Analyse for virus i fødevarer Anna Charlotte Schultz og Birgit Nørrung Danmarks Fødevareforskning

Norovirus – klassifikation og påvisning Familie Genus Vært Calicivirideae Lagovirus hund, hare Vesivirus kat (FCV), svin, søløve, andre Norovirus human, bovine, svin, mus (MNV) Sapovirus human, svin Virus partikler: små (30 nm), runde (struktureret) Genome : 7.5 kb RNA sense (kun to strukturelle proteiner) Virus påvisning i fæcesprøver Celle kultur: nej, (kun muse norovirus) Dyre model: nej, (chimpanser) Mikroskopi: Ja, elektron mikroskopi Antistof/antigen Ja, ELISA Molekylærbiologisk Ja, RT-PCR (konv og realtime), NASBA Eneste påvisningsmulighed i fødevarer De molekylærbiologiske metoder CV have a broad host range and cause a wide spectrum of disease syndromes Lagoviruses: infect rabbit (fatal, hemorrhagic disease) and hare Vesiviruses: 1. vesicular lesions and reproductive failure (pigs (VESV), sea lions and other marine animal species) 2. respiratory disease (cats and cattle) 3. Gastroenteritis (dogs)

Problemstillinger ved virus detektion i fødevarer Infektiv dosis er meget lav (10 kopier) Norovirus kan ikke dyrkes/opformeres Virus er oftest ikke fordelt jævnt i fødevaren Fødevarer indeholder mange enzym inhibitorer (fedt, proteiner og mineraler) Ekstraktionsmetoder er matrixafhængige Mangel på universal primere til de mange subtyper af NLV Fødevarer/østers kan indeholde flere subtyper af NLV En RT-PCR påvist NLV eller HAV er ikke nødvendigvis infektiøs Gode laboratoriefaciliteter er yderst påkrævet

Virus detektion i fødevarer Virus opkoncentrering RNA oprensning RT-PCR / RT-nested-PCR / RT-boosted-PCR Kloning til bakterievektor Sekventering Sekvenssammenligning og subtype bestemmelse

Norovirus – fylogenetisk Fort Lauderdale Saint Cloud Alphatron Fayetteville Snow Mountain Kashiwa47 Melksham Hillingdon GII: human Erfurt 546 290/White River Girlington GIV: human Idaho Fall VA97207 Hawaii 314/S19/94 Wortley/90 Amsterdam M7 Jena 273/Gwyned Leeds GIII: bovine Limburg Sw918 Seacroft Newbury Swine NoV Mexico CH126 Toronto Bristol Lordsdale Blakemore GV: murine Chiba Koblenz Winchester MNV-1 Thistle Malta 318/S05/95 Desert Shield Musgrove 0.1 Stavanger GI: human WhiteRose Southampton Norwalk KY89 Hesse Unrooted tree based on uncorrected amino acid distances Sindlesham Jan Vinjé, UNC, 2005

Undersøgelse af hindbær NoV-RNA oprensning fra 3 poser hindbær modtaget fra Ålborg sygehus A. (Centricon) B. (Baylor) C. (Baylor/Boom) Virus eluering Homogenisering i Tris-Glycine buffer pH=9.5, (yderligere pH indstilling til 9.5 og kernefiltrering) oprensning Opkoncentrering ved Centricon tubes Chloroform-butanol, CatFloc, PEG/NaCl RNA ekstraktion RNeasy plant kit, QIAgen Proteinase K phenol/CHCl3 CTAB Glasmælk (silica) Guanidin thiocyanat RT-PCR Nested RT-PCR, (Real time RT-PCR) Prøvestørrelse: 10 gram Process kontrol: FRNA kolifag Qβ

Princip i ”Baylor” oprensnings metoden Formål: At fjerne enzyminhibitorer og bevare RNA Virus opkoncentrering Tris - Glycin pH 9.5. pH: fra ca. 2 - 9.5 Hindbærvæv RNA ekstraktion Metoderef: Le Guyadar et al., 2003

Polymerase genet (RdRp) NoV påvisning med konventionel RT-PCR RT-PCR 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Baylor Centricon GII: 4552-4572 GII: 4865-4884 JV12y NV110 - - - - - - - - - - - - 311 bp - - - - - - - - - - RT-PCR: QIAgen One Step RT-PCR 5’- Polymerase genet (RdRp) - 3’ Nested PCR 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Hemi nested PCR: 2. PCR (De Medici et al 2004 mod) GII: ~ 4573-4593 GII: ~ 4768-4788 Lib290 NIr - - - - - - - - - 215 bp - - - - - - 4552 - JV12y................NVp110 - 4884 - 3’

Sekvens resultater Sequence: NoV GGII.4 95% ~ Patient sequence from ”Medirest” (RIVM database, FBV-EU): 100% ~ GGII.4 Lordsdale strains from NL2002, HU2003)

NoV påvisning med RT - realtime PCR 5’- ORF 1 - 3’ ORF 2 QNIF2d 5012-5037 COG2R 5080-5100 QNIFS TAMRA FAM 5042-5061 PCR:

Påvisning af norovirus Hvornår bør Fødevarer undersøges for virus Når der er mistanke om en fødevarer som primær smittekilde (Østers, bær,salat) og der er påvist virus i patienter Metoderne er endnu ikke udviklet til andre typer af fødevarer Ved udbrud hvor køkkenpersonale er påvist smittet og har håndteret forskellige fødevarer er viruspåvisning i diverse fødevarer af mindre kontrolmæssig interesse Analyse af partier af importerede frosne bær kan ikke benyttes som eneste sikkerhed for at der ikke er norovirus tilstede HACCP og hygiejneforhold ved produktion er essentiel Positivt resultat er ikke ensbetydende med at virus er infektiv

Kultiverbare eksempler på modelvirus til NoV FRNA bakteriofager (MS2 el. Qβ): Virus der inficerer E. coli Hurtig og let at dyrke Bakterie assay og RT-PCR metoder Feline Calicivirus (FCV): Benyttet model virus for NoV grundet dens familie tilhørsforhold, kultiverbarhed og mange ens karakteristika Celle assay og RT-RealTime PCR metoder Murine Norovirus (MNV): Nylig kultiverbar Formentlig bedre model virus end FCV, grundet specie tilhørsforhold Celle assay og RT-PCR metoder

FRNA bakteriofager (MS2 el. Qβ): Indikatororganismer E. coli E. Coli indikator på fækal forurening Påvisning af E. Coli siger ikke at der er norovirus tilstede men kan indikere en risiko E. Coli dør hurtigere ud end norovirus Fravær af E. coli betyder ikke at tilstedeværelse af norovirus kan udelukkes FRNA bakteriofager (MS2 el. Qβ): Overlever bedre end E. coli på vores breddegrader Inaktiveres af UV-lys

Forskning og udvikling vedr. Standardiserede påvisningsmetoder Effekt af forskellige fysisk/kemiske forhold på infektivitet Risikofaktorer ved produktion

Tak for opmærksomheden