Efteruddannelse i Bioteknologi

Præsentationer af emnet: "Efteruddannelse i Bioteknologi"— Præsentationens transcript:

1 Efteruddannelse i Bioteknologi
Kursus A

2 Kursus indhold

3 Oprensning af PCR-fragment
Reaktionsblanding: PCR-produkt Primere Template Enzym MgCl2 Nukleotider

4 Metode Gelfiltrering Glasfilterbinding Ethanolfældning
PCR-produkt i gennemløb Små molekyler tilbageholdes Glasfilterbinding Kun til store PCR fragmenter PCR –produkt tilbageholdes Små molekyler løber igennem Ethanolfældning Umoderne!

5 Proofreading polymerase
Taq-DNA-polymerase indsætter et ekstra A i 3’-enden Taq-DNA-polymerase mangler 3’-5’ proofreading Proofreading DNA polymerase fjerner 3’-A (Klenow-fragment af DNA-PolI, Pfu mv.) RESULTAT: PCR-fragment med blunt-ender

6 Restriktions enzym BglII (Bacillus globigii) Sticky ends - 5’ overhang

7 Restriktions enzym Sma I Serratia marcescens Blunt ends

8 Plasmider

9 Plasmider

10 Konjugering

11 Kromosom transfer

12 Selektions- markør fx AmpR
Plasmid konstruktion Selektions- markør fx AmpR MCS Promotor fx LacZ Selektions- gen fx LacZ’ Origin of replication

13 pBR322

14 pUC18

15 Lac operon

16 b-Galactosidase b-D-Galactosid D-Galactose IPTG X-Gal

17 Blue-white selection

18 Blue-white selection

19 Arabinose operon

20 GFP

21 Plasmidet pJet1.2 Blunt-ended
2,974 bp

22 Konstruktet

23 Ligering T4 DNA-ligase MgCl2 ATP

24 Mulige resultater

25 Transformation af E.coli

26 Kompetente E. coli celler
Friske voksende celler! Behandles iskoldt med: CaCl2 MgCl2 MgSO4 RbCl DMSO PEG Vask Koncentration Behandles forsigtigt og på is!

27 Transformation Kompetente celler inkuberes på is 5 – 10 min
Varmechock 42°C (50 sec.) Varm medie – med glucose Spredes på en varm agarplade med selections-antibioticum Succesrate: kolonier/µg plasmid

28 Electroporation Elektrokompetente celler Glycerol Lav ionstyrke
Ladning skal bæres af DNA!

29 Electroporation

30 Electroporation

31 Gennemgang af forsøgsvejledning
Se i mappen