Varmeresistente bakterier i sygehusmiljøet Karen A. Krogfelt, prof Martin S. Bojer, phd-stud Afd Mikrobiologi og Infektionskontrol Statens Serum Institut

Antibiotikaresistensens onde cirkel B. Kristensen: ,SSI

Multiresistente bakterier The good (ydre overflader, ex hud) MRSA The bad (indre overflader, ex tarm) ESBL, VRE The ugly ( stor spredningspotentiale, høj mortalitet) NDM-1 og andre carbapenemase-dannende bakterier CD027 B. Kristensen, SSI

Varmeresistens ….

Historien… Gentamicin-resistente enterobakterier, Hvidovre Hospital. Mindst 10 infektioner over 2-år på intensivafdelingen af multiresistente K. pneumoniae-isolater, kapsel serotype K28 Ribotypning viste at isolater er klonale

Virulens undersøgelse af C132-98 Adhæsion til humane epithelceller Evne til at kolonisere tarmen Infektionsevne i urinvejsinfektions model C132-98 er ikke mere virulent end andre kliniske K. pneumoniae isolater (Struve & Krogfelt, 2004)

til at persistere i hospitalsmiljøet ? Har C132-98 forøget evne til at persistere i hospitalsmiljøet ? C132-98 overlever ved høje temperaturer 58°C Special-apparatur, f.eks. endoskoper, varmebehandles ved temperaturer under 60 °C. Temperatur kritisk for at minimere ”bacterial load” (Zühlsdorf et al., 2003)

Varmeresistens gen ? C132-98 har mange plasmider Er varmeresistens plasmid-kodet? C132-98 plasmid DNA skæres med Sau3A Ligeres med plasmid vektor Plasmid-klon bibliotek i E. coli Forskellige plasmid kloner

Selektion af varmeresistens Restriktionsanalyse af individuelle kloner Restriktionsanalyse af individuelle kolonier Præ-selektion pool Gentagen varmeselektion Post-selektion pool 4x 58 °C i 5 min 384 clones 1 klon? Én varmeresistent klon selekteret

Sekventering af varmeresistent klon Varmeresistent klon (8.187 kb fragment fra K. pneumoniae C132-98) Clp ATPase sHSP hypothetical proteins 93 aa 189 aa 967 aa 228 aa 152 aa 304 aa 295 aa Putative metalloprotease Clp ATPase genet (clpK) medierer varmeresistens

kloning af clpK 53°C clpK-genet alene medierer varmeresistens

K. pneumoniae C132-98 varmeresistens = clpK?

ClpK på konjugative plasmid C132 C132Δclp DH5α tetracycline resistant transformants ClpK på største plasmid (ca.150 kb) i C132-98

Funktion af Clp ATPpaser Funktionel gruppe I Clp ATPaser involveret i ClpP-afhængig proteolyse (ClpA, ClpC, ClpX) Protein destined for degradation Binding ClpP double-heptameric proteolytic complex Clp hexamer Degradation Translocation Catalyzed denaturation (Modificeret fra Karzai et al. (2000))

Funktion af Clp ATPpaser Funktionel gruppe II ClpP uafhængige, medierer protein-disaggregering (ClpB) ClpB cross-section Insoluble aggregate Extraction & threading of polypeptide Interaction of ClpB, DnaK & protein aggregate DnaK chaperone system Release of unfolded polypeptide Spontaneous or chaperone mediated refolding Pore (Modificeret fra Doyle et al. (2007))

ClpK er en ny type Clp ATPase Funktionel gruppe I (ClpP afhængig proteolyse) C-terminal AAA-2 M-domain AAA-1 N-terminal ClpA ClpX ClpC P tripeptide Gram-negatives Both Gram-positives Funktionel gruppe II (protein disaggregering) ClpB C-terminal AAA-2 M-domain AAA-1 N-terminal Both ClpK N-terminal AAA-1 M-domain AAA-2 C-terminal Bojer et al., 2012

clpK hos K. pneumoniae 105 kliniske isolater screenet med clpK specifik DNA probe 31 isolater positive! ClpK er vidt udbredt blandt kliniske isolater (30%)

clpK- K. pneumoniae er varmeresistente Bojer et al., 2010

Varmebehandling af biofilm 5 min v. 58 °C clpK og K. pneumoniae biofilm Varmebehandling af biofilm 5 min v. 58 °C Bojer et al., 2011

clpK på ESBL-plasmider Dansk samling af ESBL-positive K. pneumoniae blodisolater fra 2008 (Lester et al., 2010) 24% positive Findes i større sjællandsk klon ST16 Bojer et al., 2012

clpK på ESBL-plasmider MLST antal Antal isolater i dette PFGE/MLST-cluster (Lester et al.) Genotype ESBL-konjugation ST15 1 38 CTX-M-15, SHV-28, TEM-1 + (IncFIIk, clpK) ST16 9 CTX-M-15, SHV-1, TEM-1 ST110 2 5 CTX-M-15, SHV-12 - ST11 3 DHA-1 ST474 CTX-M-15, SHV-11, TEM-1 + (IncFIIk) ST469 + (IncN) ST20 CTX-M-14, SHV-11 + tet, neo, sulpha, trim!! 53°C 53°C

I ALT Varmeresistens i persisterende stamme på sygehus Varmeresistens er plasmid-kodet og medieret af ny type af Clp ATPase :clpK clpK er hyppigt forekommende hos kliniske K. pneumoniae isolater Tydelig sammenhæng mellem tilstedeværelse af clpK og varmeresistens clpK medierer varmetolerance også for biofilm clpK er påvist på konjugerbart multiresistens-plasmid i bl.a. udbredt sjællandsk ST16-klon

I ALT Tydelig sammenhæng mellem clpK og varmeresistens clpK medierer varmetolerance også for biofilm clpK er på konjugerbart multiresistens-plasmid

Hvad så? Findes clpK i andre relevante species? Giver ClpK anledning til andre stress-fænotyper? Findes clpK i andre relevante species? Fødevare-sikkerhed/tilberedning? Vask ved lav temperatur? ClpK selektion??

TAK Deltagende parter Anette M. Hammerum , SSI Hanne Ingmer, KU-Sund Dennis S. Hansen, Hillerød Sygehus Carsten Struve, SSI 58 °C i 5 min 384 clones 1 klon