Protein Science A - Basic Lab Dias 1 14. September GST-FYVE oprensning Kasper Kistrup, Niels Højsgaard og Mads Topp Nano-Science Center.

Præsentationer af emnet: "Protein Science A - Basic Lab Dias 1 14. September GST-FYVE oprensning Kasper Kistrup, Niels Højsgaard og Mads Topp Nano-Science Center."— Præsentationens transcript:

1 Protein Science A - Basic Lab Dias 1 14. September GST-FYVE oprensning Kasper Kistrup, Niels Højsgaard og Mads Topp Nano-Science Center

2 Protein Science A - Basic Lab Dias 2 14. September Oprensning af GST-FYVE Indsætning af gen i plasmid vektor  Indsæt vektor i værtscelle (Transfektion)  Lad populationen gro (inkubering v. 37ºC)  Udtrykning af vores gen (Inducering v. IPTG)  Selektion  Høst af celler / Sonikering  Affinitets kromatografi

3 Protein Science A - Basic Lab Dias 3 14. September DNA Kloning

4 Protein Science A - Basic Lab Dias 4 14. September Høst og oprensning Centrifugering og dekantering af supernatant Pellet af E.coli tilbage Sonikering Cellelysis Centrifugering Store celledele (Lysozyme, membraner etc) bundfældes (Gem prøve, P4) Supernatant filtreres i et Millipore filter (Store proteiner etc) (Gem prøve, P3)

5 Protein Science A - Basic Lab Dias 5 14. September Affinitets kromatografi Protein prøve i søjle Eluering af uønskede proteiner (Gem prøve, P5) Vask med PBS for at fjerne uønskede proteiner (Gem prøve, P6) 10x1mL eluerings fraktioner Fraktion 2 og 3 udtages (P8 og P9) Regenerer søjlen

6 Protein Science A - Basic Lab Dias 6 14. September Indhold af SDS-brønde LMW (Markør) P1 – E.coli P2 – E.coli efter 4 timers inkubation P3 – Supernatant efter sonikering og centrifugering (Spild) P4 – Bundfald efter sonikering og centrifugering P5 - Eluering af uønskede proteiner P6 - Vask med PBS for at fjerne uønskede ting P8 – Eluent 2 fra søjlen P9 – Eluent 3 fra søjlen

7 Protein Science A - Basic Lab Dias 7 14. September Resultater GST-FYVE ved ~40-42 kDa markøren (Fra SDS-gel) Fra MALDI-TOF: GST-FYVE vejer 41 kDa