Proteiner og massespektrometri Udover vand, er de stoffer, som der er mest af i vores krop, proteiner. Proteiner er stoffer, der f.eks. bruges som kroppens byggematerialer og dermed er med til at give de celler, som kroppen består af, deres struktur. Desuden virker mange proteiner som små maskiner (enzymer), der eksempelvis medvirker til at danne energi til kroppens celler fra den mad, vi spiser. Proteiner er dannet af lange kæder af en type af kemiske stoffer kaldet aminosyrer. Korte kæder af aminosyrer kaldes peptider. Da proteiner medvirker i så mange processer i vores krop, er de også involveret i de fleste sygdomme, hvilket gør det vigtigt at vide, hvordan de fungerer både enkeltvis og indbyrdes for at kunne forebygge og behandle disse sygdomme. Viden om, hvordan proteinerne fungerer kan bl.a. opnås ved hjælp af massespektrometri (også kaldet MS), der er en teknik, der kan bestemme massen (vægten) af meget små molekyler. Ved at kende vægten af et protein og rækkefølgen af de aminosyrer, som udgør proteinet, kan man ved hjælp af computerbaserede databasesøgninger identificere proteinet. Før man skal analysere et protein, bliver det ofte fordøjet (nedbrudt) til peptider ved hjælp af et fordøjelsesenzym, da peptider er lettere at analysere end et helt protein. Protein Peptider Nedbrydning til små dele (peptider) vha. fordøjelsesenzym

Nedbrydning af peptider Proteiner og Massespektrometri Massespektrometrets ionkilde laver først peptiderne om til ladede stoffer (ioner), som kan flyve i et elektrisk felt. Vægten af et peptid kan f.eks. bestemmes (alt efter typen af massespektrometer) efter, hvor lang tid det tager peptid-ionen at flyve en vis afstand i et lufttomt rør i massespektrometret, inden de rammer en detektor. De første peptider, som når detektoren, er de letteste, mens de tungeste er længere tid om det. Udover vægten af et peptid, kan den nøjagtige rækkefølge af aminosyrer i et peptid også bestemmes. Dette sker, ved at lade peptip-ionen kollidere med en gas-art i røret, hvorved peptidet bliver nedbrudt til mindre stykker, hvis vægt man selvfølgelig også kan bestemme. Denne proces kaldes MS/MS, da man først laver massespektrometri på peptidet og derefter på dets fragmenter. Ud fra vægten af disse fragmenters kan aminosyrerækkefølgen bestemmes. Ion-kilde hvor de ladede peptid-ioner dannes Lufttomt rør med elektrisk felt Detektor Computer + - Flyveretning Ion-kilde hvor de ladede peptid-ioner dannes Detektor Computer + - Flyveretning Område i rør med kollisions-gas Nedbrydning af peptider til aminosyrer ved kollision med gas Alanin Glycin Prolin Argenin Serin

Proteiner og Massespektrometri Når man både kender peptidets masse og aminosyrerækkefølge, kan man ved hjælp af en computer søge efter dette bestemte peptid i en database over alle kendte proteiner og dermed finde det protein peptidet stammer fra. Ved at udnytte disse massespektrometriske teknikker kan man designe eksperimenter, som kan afsløre, hvilken rolle proteinerne spiller i en bestemt sygdom, og dermed give mulighed for at lave lægemidler, som kan kurere sygdommen. Identifikation af peptider Computerbaseret databasesøgning Aminosyrerækkefølge: glycin-serin-alanin-prolin-argenin Vægt: 543.3 Da Proteinsekvens: …alanin-lysin-glycin-serin-glycin-alanin-prolin-argenin-alanin-leucin-… Teoretisk peptid-vægt: 543.27649 Da Aminosyresekvens: glycin-serin-glycin-alanin-prolin-argenin Målt peptid-vægt: 543.3 Da Match:  Behandling af data

Identifikation af et protein vha. massespektrometri Nedbrydning til små dele (peptider) vha. fordøjelsesenzym Analyse af peptider vha. massespektrometri Protein Peptider MS (bestemmelse af peptiders masse) MS/MS (bestemmelse af peptiders aminosyrerækkefølge) Ion-kilde hvor de ladede peptid-ioner dannes Lufttomt rør med elektrisk felt Detektor Computer + - Flyveretning Ion-kilde hvor de ladede peptid-ioner dannes Detektor Computer + - Flyveretning Område i rør med kollisions-gas Nedbrydning af peptider til aminosyrer ved kollision med gas Alanin Glycin Prolin Argenin Serin Identifikation af protein Behandling af data Computerbaseret databasesøgning Identifikation af peptider Aminosyrerækkefølge: glycin-serin-alanin-prolin-argenin Vægt: 543.3 Da

Et massespektrum Hver signal/top i massespektret repræsenterer en peptid-ion. Ud af x-aksen er vægten af ionen og op ad y-aksen signalets styrke Zoom Peptid kun indholdende lette isotoper Peptid indeholdende et enkelt atom af en tung isotop Peptid indeholdende to atomer af tunge isotoper Her er der zoomet ind på en enkelt peptid-ion. Den udgøres af en række såkaldte isotop-toppe. Dette skyldes, at atomerne af de grundstoffer, som peptidet indeholder, findes i forskellige udgave (isotoper). F.eks. findes kulstof (carbon) mest som kulstof-12, men ca. 1% af alt kulstof på Jorden er det tungere kulstof-13. Derfor findes der mange udgaver af peptid-ionen i massespektret, som indeholder forskellige kombinationer af lette og tunge isotoper. Den letteste top (længst til venstre) er en peptid-ion kun indeholdende de letteste isotoper af grundstofferne i peptidet (f.eks. kulstof-12, nitrogen-14 eller hydrogen-1), mens den næste indeholder et enkelt atom af de tungere isotoper (f.eks. kulstof-13, nitrogen-15 eller hydrogen-2), den næste indeholder to tunge isotoper osv.

Massespektrometri på et peptid MS spektrum (fuldt spektrum) Peptid-ion udvalgt til fragmentering (631,78) MS/MS MS/MS spektrum (zoom i massespektrum over nogle af fragmenterne fra 730,32 ionen ) aspartat isoleucin alanin Efter fragmentering af peptidet med massen 631,78 kan noget af aminosyrerækkefølgen ”læses” ved hjælp af afstanden mellem de forskellige toppe i massespektret, der svarer til vægten af de enkelte aminosyrer i peptidet. Dette peptid indeholder altså aminosyrerne aspartat, isoleucin og alanin. Denne information, sammen med den nøjagtige vægt af peptidet kan bruges til at identificere det protein, peptidet stammer fra. D D I I A A D I A