ג. קביעת רצף נוקלאוטידים ב DNA. א.Southern Blotting . ב. PCR-Polymerase. ג. קביעת רצף נוקלאוטידים ב DNA.
א.Southern Blotting. Edward M. Southern (1975) פיתח את השיטה אשר בעזרתה ניתן לזהות רצף ספציפי מתוך אוסף פרגמנטים של .DNA גם שיטה זו, בדומה לסריקה של ספריית DNA עושה שימוש בגלאים.
תיאור התהליך אנימציה
יישומים של Southern Blotting שיטת ההכלאה הדרומית מהווה כלי יעיל למספר מטרות: מיפוי של גנים. זיהוי של גנים ביצור. השוואתם בין גנים ביצורים השונים. גילוי שינויים (מוטציות) בגנים. זיהוי פלילי, ועוד...
גילוי שינויים (מוטציות) בגנים יצירת הגלאי לשני סוגי ההמוגלובין. לקיחת דגימות דם משלושה פרטים והרצתם בשני ג'לים. בצוע תהליך של הכלאה דרומית בעזרת הגלאים. תוצאות: לפרט 1 אין גן פגום, לפרט 2 יש שני גני פגומים ואילו פרט ,3 יש גן אחד תקין וגן אחד פגום.
שיטות נוספות של Blotting Northing blotting- הספג צפוני, בשיטה זו משתמשים בגלאי של RNA מסומן לגילוי הרצף המבוקש. Western blotting- בשיטה זו מפרידים חלבונים ומשתמשים בנוגדנים מסומנים לזיהוי חלבון המבוקש.
ב. PCR-Polymerase Chain Reaction שיטה להגדלת כמות של מקטע DNA ייחודי במבחנה. 1993 ממציא ה-PCR ד"ר K. B. Mullis זוכה בפרס נובל בכימיה.
תיאור התהליך DNA דו גדילי. א ב ג א. Denaturation – הפרדה של הגדילים ע"י חימום ב Cº 94 למשך 5 דקות. ב. Annealing- הדבקת הפריימרים ע"י חמום ב Cº 50 במשך 0.5 דקה (משך החימום תלוי באורך הפריימרים). ג. Synthesis- ייצור DNA דו גדילי בעזרת נוקלאוטידים והאנזים Taq polimerase , חמום ב Cº 72 במשל 5 דקות. אנימציה
יישומים שיטה זו היא שיטה פשוטה, מהירה ויעילה להרבות מקטע מבוקש של DNA . אין צורך לדעת את הרצף המלא של המקטע. צריך לדעת רק את הרצף של הקצוות, וזאת ע"מ להכין את הפריימרים המתאימים. בשיטה זו למעשה מעצימים את כל היישומים שתוארו בSouthern Blotting גם לכמויות מזעריות של דגימה. דוגמא: זיהוי נשא של נגיף ה AIDS. לוקחים טיפת דם. מאחר שהגנום של הנגיף עשוי מ RNA יוצרים.CDNA עושים PCR. מריצים בג'ל.
ג. קביעת רצף נוקלאוטידים ב DNA. בשנת 1977 פיתחו החוקרים Maxam & Gilbert שיטה מהירה לקביעת רצף נוקלאוטידים בDNA . במקביל לכך פיתח חוקר בשם Sanger טכניקה נוספת לקביעת הרצף. בשנת 1980 זכו שלושת החוקרים בפרס נובל (ל Sanger היתה זו זכייתו השניה בפרס).
שיטת Maxam & Gilbart מפיקים מקטע DNA חד גדילי, המסומן בסמן רדיואקטיבי בנוקלאוטיד הראשון. לוקחים 4 מבחנות. בכל מבחנה מוסיפים מגיב אשר פוגע באחד מן הנוקלאוטידים (בכל מבחנה הפגיעה תהיה בבסיס אחר). ריכוז המגיב הוא מחושב שרק מקצת הבסיסים נפגע.
מריצים, כל מבחנה בנפרד, באלקטרופוזה בג'ל מריצים, כל מבחנה בנפרד, באלקטרופוזה בג'ל. באופן זה מפרידים את המקטעים ע"פ גודלם. זיהוי הפסים יעשה ע"י אוטורדיוגרפיה. סדר הפסים שמתקבל בג'ל מצביע על רצף הנוקלאוטידים.
שיטת Sanger ייצור של ה DNA מתבצע ע"י נוקלאוטידים deoxyribonuleoside triphosphate-dNTP. אנלוגים של נוקלאוטידים dideoxyribonuleoside triphosphate -ddNTP מונעים את הסינטיזה של ה DNA.
אם בעת הייצור ה DNA מערבבים את שני סוגי הנוקלאוטידים, הסנטוז יעצר, במקום בו יכנס האנלוג.
מפיקים DNA חד גדילי עם פריימר מסומן בקצה 5'. לוקחים 4 מבחנות בכל מבחנה מוספים נוקלאוטידים (dNTP) וכן את האנזים פולימרז. בכל אחד מן המבחנות מוסיפים אנלוג אחר של נוקלאוטידים (ddNTP). בכל מבחנה ייצור הDNA הדוגדילי יעצר באופן אקראי בנוקלאוטיד אחד. מריצים, כל מבחנה בנפרד, באלקטרופוזה בג'ל. המקטעים השונים מופרדים ע"פ גודלם. זיהוי הפסים יעשה ע"י אוטורדיוגרפיה. 7. סדר הפסים שיתקבל בג'ל מצביע על רצף הנוקלאוטידים.
ריצוף מחזורי Cycle sequencing תהליך זה של מיפוי של הDNA יכול להעשות גם ע"י שימוש בנוקלאוטידים ((ddNTP המסומנים בסמנים פלולרוצנטיים. השימוש בסמנים הפלורוצנטיים השונים מאפשר ביצוע התהליך במבחנה אחת. אנימציה מיפוי הגנום האנושי שיטות המיפוי שתוארו לעיל בשילוב עם טכנולוגיות DNA נוספות, כדוגמת הטכנולוגיה ליצירת ספריות גנומיות, אפשרו את מיפוי הגנום האנושי. אנימציה