Iltmangel i Regnbueørred Genomics, proteomics og cellesignalering FIBP: Fish Physiology, Biochemistry and Food.

Præsentationer af emnet: "Iltmangel i Regnbueørred Genomics, proteomics og cellesignalering FIBP: Fish Physiology, Biochemistry and Food."— Præsentationens transcript:

1 Iltmangel i Regnbueørred Genomics, proteomics og cellesignalering FIBP: Fish Physiology, Biochemistry and Food

2 De involverede personer Docent Else Kay Hoffmann, Ph.D. (Institut for Molekylærbiologi, KU) Senior forsker Flemming Jessen, Ph.D. (Afd. for Fiskeindustriel Forskning, DFU, DTU) Ph. D.-stipendiat Tune Wulff, cand. scient. (Institut for Molekylærbiologi) Post doc. Carlo G. Ossum, Ph.D. (Institut for Molekylærbiologi) Professor Niels C. Bols, Ph.D. Professor Mathilakath M. Vijayan, Ph.D. Vores samarbejdspartnere: University of Waterloo, Ontario, Canada: University of Liverpool, Liverpool, UK: Professor Andrew Cossins, Ph.D. Syddansk Universitet, Odense: Professor Peter Roepstorff, Ph.D.

3 RTHDF cellelinien RTHDF – rainbow trout hypodermal fibroblasts – blev isoleret fra muskeloverfladen og kan således forventes at indgå i den spiselige del af fisken. Cellelinien opstod uden manipulation af de primære celler. Så vidt vi ved, er dette den første cellelinie fra spiseligt væv hos laksefisk. (Ossum et al., 2004)

4 Vores modelsystemer Cellerne oplever en ilt-mangel lignende situation når vi behandler dem med stoffet natrium azid (NaN 3 ) og egentlig iltmangel når vi behandler med kvælstof (N 2 ). NaN 3 blokerer cellernes mulighed for at producere tilstrækkelige mængder ATP – cellernes energibærer. Det samme sker under iltmangel. Fjernelse af NaN 3 og N 2 lader cellerne omsætte ilt og producere ATP igen. Vores eksperimenter retter sig mod de biokemiske begivenheder, der følger iltmangel og efterfølgende geniltning.

5 Vores strategier Vi studerer ændringer i udtryk af gener (genomics). Vi studerer ændringer i udtrykte proteiner (proteomics). Vi studerer de vigtigste signalveje i cellerne som påvirkes af iltmangel (cellesignalering).

6 En scannet microarray slide Ved scanning skal arrayet virke gult Her vises et udsnit. Gul: ingen regulering Grøn: opreguleret Rød: nedreguleret Hvid: skyldes mætning

7 Detektion ved hjælp af hybridisering Plade med ca 22.000 kendte gener probes med cDNA fra kontrollceller og eksperimentelt behandlede celler, der er farvet hhv grønt og rødt. Ratioen mellom grøn og rød farvning kan bestemmes og dermed give en kvantificering af genudtrykket. CATG GTAC

8 Funktion Op reguleret Ned reguleret Cellulære fysiologiske processer2214 Metabolisme2213 Proteinmetabolisme87 Regulering af biologiske processer65 Regulering af fysiologiske processer65 Energiveje70 Lipidmetabolisme25 Kulhydratmetabolisme60 Regulering af metabolisme33 Respons på stress33 Signal transduction33 Celleorganisering14 Respons på DNA skade12 Hvilke typer gener bliver ændret efter iltmangel

9 Proteomanalyse 2-dimensional gel-elektroforese Farvning af proteinerne Scanning af gelerne Billedbehandling Sikre sammenligning af de rigtige proteiner Måler mængden af de enkelte proteiner Massespektrometri Identificerer de enkelte proteiner

10 1.D: Ladnings adskillelse/isoelektriskfokusering 2.D: Størrelses adskillelse/SDS-PAGE Proteinekstraktion Pletter fra 2D gelen udskæres og proteinet identificeres ved massespektrometri Sølvfavning viser alle proteiner i 2D gelen Flowchart af proteomeanalyse 4,0 7,0 pH MW pH

11 2-dimensional gel pI 47 Mw 120 12 Mere end 1500 forskellige pletter

12 NavnBiologisk proces Uridine phosphorylase 1Kulhydrat metabolisme TransaldolaseKulhydrat metabolisme Taldo1 proteinKulhydrat metabolisme Phosphoglycerate mutase 1Metabolisme Isocitrate dehydrogenase (nad+)alphaMetabolisme Calpain, small subunit 1Apoptosis/Migration Rho GDP dissociation inhibitor (GDI) alphaSignal transduction Proteasome subunit beta type 3Protein nedbrydning Chloride intracellular channel 1Transport of Klorid EB1Microtubule binding Annexin 4Membrane fusion/Regulering af PLA2 Annexin A5Membrane fusion/Regulering af PLA2 Beta-actinStructural del af cytoskeletet Simple type II keratin K8a (S1)Structural moleculær aktivitet BAG family molecular chaperone regulator 2Regulering af Hsp70, Bcl-2, Raf-1 Peroxiredoxin 6Antioxidant defense Hvilke typer proteiner bliver ændret efter iltmangel

13 Cellulær signallering Overlevelses og stress signaler ERK – extracellular regulated protein kinase – er et signalprotein, der stimulerer cellernes vækst og delingsprocesser. ERK er derfor et overlevelsesprotein. p38 er et stress-aktiveret signalprotein, der er vigtig for at tilpasse sig et stressfyldt miljø, og den er involveret i celledød. p38 er derfor et stress-protein. Hsp70 – heat shock protein 70 – er et beskyttelsesprotein, der produceres som en reaktion mod skadeligt stress. Vi kan se på Hsp70 som en slags cellulær vicevært.

14 Hvorfor studere disse proteiner? ERK og p38 tilhører en gruppe signalproteiner, hvis aktivitet set i forhold til hinanden, er afgørende for cellernes liv og død. Hsp70 kan reparere skadede proteiner eller sende dem til nedbrydning. Hsp70 medvirker også til hæmming af programmeret celledød.

15 Metoder brugt her: SDS-PAGE & Western blotting Forsøg og ekstraktion af protein MW SDS-polyacrylamid elektroforese Overføring til nitrocellulose, vha elektroblotting. Dvs at sætte strøm 90  på gelen. Fremkalding af resultat Kvantificering og databehandling. +++++++++ - - - - - - - - -

16 ERK og p38 Cellekernen ERK p38 Funktioner Vækst hæmning. Celledød Stimulering af vækst og celledeling Ilt- mangel

17 ERK hæmmes og p38 aktiveres af kemisk iltmangel Der er anvedt antistoffer, der genkender de fosforylerede proteiner. Fosforylering af disse proteiner, indikerer aktivering. Phospho- p44ERK 50 kDa 40 kDa 51030(min) Anoxia Phospho-p38 51030 (min) Anoxia

18 p38 hæmmer ERK SB203580 er en kemisk hæmmer, der er specifik for p38. Phospho- p44ERK 50 kDa 40 kDa Normoxia Normoxia + SB203580 Anoxia Anoxia + SB203580 *

19 Geniltning aktiverer ERK uafhængigt af den normale aktiveringsvej for ERK, som går over proteinet Raf Normoxia Normoxia + RKI Anoxia Anoxia + RKI A/R A/R + RKI Phospho- p44ERK 50 kDa 40 kDa RKI = Raf kinase inhibitor; en specifik kemisk hæmmer af proteinet Raf. Anoxia Recovery 50 kDa 40 kDa 51030(min)60 Phospho- p44ERK

20 Model for cellesignaleringen under iltmangel og geniltning af fiskecellerne Kemisk iltmangelGeniltning p38 MAPK NAD(P)H oxidase ROS Src PKC MEK ERK Ras MEK ERK Raf O2O2 O2O2 RPTK P P P P Serum, Normal ilt Grb2 Ras MEK ERK Raf SOS MEKK1

21 Proteinet Hsp70 – cellulær vicevært Foldet proteinDenatureret protein Stress ATP ADP ATP ADP Semi-foldet protein PiPi K+K+ Hsp40 Hsp70 Hip ATP ADP Bag/Hop Destruktion ADP Reparerer beskadigede proteiner eller sender dem til destruktion

22 Tidsafhængig ekspression af Hsp70 under iltmangel 5 min10 min 30 min 0 Hsp70 A Kontrol, 21°C Heat shock, 28°C B Hsp70 Hvis RTHDF celler udsættes for kemisk anoxi i 30 minutter udtrykkes Hsp70. Vores undersøgelse (Ossum et al., 2004) er den første der viser Hsp70-expression efter iltmangel i fiskeceller.

23 Metode: Real-time PCR PCR – Polymerase chain reaction – er en metode for opformering af en specifik DNA sekvens. PCR sker ved brug af primere, der definerer den ønskede DNA sekvens og en DNA polymerase: 3’ 5’ PrimerDNA polymerase 3’ 5’ PrimerSyntetiseret DNA 3’ 5’ Primer DNA polymerase F Q Ved real-time PCR anvender man en probe med en fluorofor (F) og en quencher (Q). DNA polymerasen vil frigive fluoroforen og da kan vi måle lys-signalet og anvende dette til kvantificering af et specifikt genudtryk.

24 hsp70 mRNA geniltning bliver udtrykt ved geniltning Kemisk iltmangel Egnentlig iltmangel Genlitning efter kemisk anoxi medfører en transient aktivering af hsp70a genet. Genlitning efter egentlig anoxi fører til en aktivering af hsp70a genet efter 1 time og bliver ved over tid.

25 Konklusioner Under iltmangel sker der ændringer i cellen som foregår på mange niveauer:  Ændringer i aflæsningen af en lang række gener.  Ændringer i hvilke proteiner, der findes i cellen.  Ændringer i signaloverførsel i cellen.

26 Publikationer Carlo G. Ossum, Else K. Hoffmann, Mathilakath M. Vijayan, Shawn E. Holt & Niels C. Bols (2004). Characterization of a novel fibroblast-like cell line from rainbow trout and responses to sublethal anoxia. Journal of Fish Biology 64; 1103-1116 Carlo G. Ossum, Tune Wulff & Else K. Hoffmann (2006). Regulation of the mitogen-activated protein kinase p44 ERK activity during anoxia/recovery in rainbow trout hypodermal fibroblasts. Journal of Experimental Biology 209; 1765-1776 Tune Wulff, Else K. Hoffmann, Peter Roepstorff & Flemming Jessen. Comparison of two anoxia models in rainbow trout cells by a two- dimensional gel electrophoresis and MS/MS based proteome approach. Submitted to Molecular and Cellular proteomics. Tune Wulff, Flemming Jessen, Peter Roepstorff & Else K. Hoffmann. Long term anoxia in rainbow trout investigated by 2-DE and MS/MS. Submitted to Proteomics E-mail: cgossum@aki.ku.dk