Undervisningsplanen for S4-net molekylærbiologi og genetik PCR og PCR-RFLP Udarbejdet af Henning Ilsø, redigeret og indtalt af Birte Bunch Larsen Undervisningsplanen for S4-net molekylærbiologi og genetik Molekylærbiologi og genetik, F2008, S4 net HILS/BBLA, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen

Grundlæggende om PCR PCR efterligner i al sin enkelhed cellernes replikation, der som bekendt resulterer i en nøjagtig kopiering/fordobling af cellens arvemateriale. Vha. PCR teknikken kan vi i teorien opformere (amplificere) en hvilken som helst del (op til ca. 40 kb) af en organismes arvemateriale til millioner af kopier, som vi efterfølgende kan analysere nøjere for tilstedeværelse af mutationer. Metoden er følsom, da den kræver meget lidt DNA. Metoden er følsom for kontaminering. Molekylærbiologi og genetik, F2008, S4 net HILS/BBLA, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen

Opsætning af PCR-reaktion: reagenser og funktion En PCR reaktion skal grundlæggende indeholde følgende reagenser: Template DNA: udgangspunkt for PCR; den prøve der skal analyseres. Taq polymerase: thermostabil DNA polymerase fra bakterien Thermus aquaticus. Tåler opvarmning til 94°C og har temperaturoptimum ved 72°C Buffer: sikrer optimale betingelser for Taq polymerasen. MgCl2: Mg++ er co-faktor for Taq polymerasen. Forward primer: oligonukleotid med en længde på ca. 20 baser. Reverse Primer: oligonukleotid med en længde på ca. 20 baser. dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP): deoxyribonukleotider, dvs. DNA byggesten. Når alle reagenser er blandet, sættes reaktionen i en forprogrammeret PCR-maskine. En typisk PCR-reaktion tager ca. 1,5 time. Mere om PCR-maskine Molekylærbiologi og genetik, F2008, S4 net HILS/BBLA, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen

PCR reaction og PCR cyklus En PCR reaktion kan beskrives som en PCR-cyklus gentaget ca. 30 gange. I hver PCR-cyklus sker der en fordobling af det DNA man ønsker at opformere (target). Ved at gentage denne cyklus 30 gange ender man i teorien op med 230 ≈ 1 milliard kopier af target. En PCR-cyklus består af 3 trin: Denaturering (trin 1) Annealing (trin 2) Extension (trin 3) Molekylærbiologi og genetik, F2008, S4 net HILS/BBLA, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen

PCR-cyklus trin 1: denaturering Akkurat som det er tilfældet under replikationen, er første trin i kopieringen af DNA vha. PCR, at DNA dobbeltstrengen gøres enkeltstrenget (denatureres). I PCR sker dette ved at DNA’et opvarmes til ca. 94°C, hvorved hydrogenbindingerne i det dobbeltstrengede DNA brydes og vi får to enkeltstrengede DNA molekyler: 94°C Molekylærbiologi og genetik, F2008, S4 net HILS/BBLA, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen

PCR-cyklus trin 2: Annealing Det enkeltstrengede DNA skal nu som ved replikationen fungere som skabelon (template) for syntese af komplementære DNA strenge. For at igangsætte synteseprocessen kræves at primere i dette trin baseparrer (annealer) til template DNA. Vi nedsætter derfor temperaturen til ca. 60°C (annealings-temperaturen), hvilket tillader forward- og reverse primer specifikt at anneale til deres template: 5’ 3’ 5’ 3’ Reverse primer Mere om primere 5’ 3’ Forward primer 3’ 5’ Molekylærbiologi og genetik, F2008, S4 net HILS/BBLA, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen

PCR-cyklus trin 3: Extension Efter at primerne (starterne) har annealet til template, hæves temperaturen til 72°C, der er temperaturoptimum for den anvendte thermostabile DNA polymerase. DNA polymerasen syntetiserer nyt DNA ved at forlænge primerne i 5’3’ retningen. Med afslutningen af trin 3, er en PCR cyklus tilendebragt, og vi har en nøjagtig fordobling af det ønskede DNA område (target): Target Template 5’ 3’ 3’ 5’ Reverse primer Forward primer 5’ 3’ 3’ 5’ Molekylærbiologi og genetik, F2008, S4 net HILS/BBLA, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen

PCR - Resume Dobbeltstrenget DNA-template Den skitserede PCR-cyklus gentages ca. 30 gange, hvilket resulterer i millioner af kopier af target = PCR-produkt. PCR-produktet kan efterfølgende analyseres for tilstedeværelse af mutationer. Varmes op til 94°C Denaturering af template ved 94°C afkøles til 60°C Annealing af primere til target ved 60°C Varmes op til 72°C Extension af primere ved 72°C Molekylærbiologi og genetik, F2008, S4 net HILS/BBLA, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen

PCR - Animationer Klik på nedenstående links for illustrative PCR-animationer PCR-2 (fra Dolan DNA Learning Center) PCR-4 (fra MaxAnimations) Molekylærbiologi og genetik, F2008, S4 net HILS/BBLA, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen

PCR-RFLP mutationsanalyse Når en PCR reaktion er afsluttet kan PCR produktet efterfølgende analyseres for tilstedeværelse af mutationer. En de anvendte metoder er RFLP, der er en forkortelse for Restriktions Fragment Længde Polymorfi (Restriction Fragment Length Polymorphism). Forudsætningen for at RFLP kan anvendes i en mutationsanalyse er at den pågældende mutation resulterer i at et restriktionssite enten forsvinder eller opstår. I PCR-RFLP analyser anvendes restriktionsenzymer (isoleret fra bakterier), der genkender og klipper specifikke sekvenser (restriktionssites) i dobbeltstrenget DNA  Restriktions- fragmenter Mere om Restriktionens- enzymer Molekylærbiologi og genetik, F2008, S4 net HILS/BBLA, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen

PCR-RFLP mutationsanalyse Sekvens genkendes af Eco RI 3’ GAATTC 5’ CTTAAG Normal Allel (N) Sekvens genkendes ikke af Eco RI 3’ GAACTC 5’ CTTGAG Muteret Allel (M) Molekylærbiologi og genetik, F2008, S4 net HILS/BBLA, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen

PCR-RFLP mutationsanalyse Sekvens genkendes af Eco RI  to restriktionsfragmenter G 5’ CTTAA 3’ AATTC Sekvens genkendes ikke af Eco RI  Et fragment 3’ GAACTC 5’ CTTGAG Molekylærbiologi og genetik, F2008, S4 net HILS/BBLA, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen

PCR-RFLP visualisering ved gelelektroforese - Restriktionsmønstret afslører ens genotype Homozygot normal genotype (NN) Homozygot muteret genotype (MM) Heterozygot genotype (NM) Molekylærbiologi og genetik, F2008, S4 net HILS/BBLA, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen

Primerne bestemmer annealingstemperaturen Annealingstemperaturen i en PCR fastlægges ud fra primernes smeltetemperatur (Tm), der afhænger af primerens længde og basesammensætning. For primere med en længde på 14-25 baser kan følgende tilnærmede formel benyttes: Tm ≈ 2x(A+T) + 4x(G+C) primer 1: ATTGTATACGTAGTAATCGT Tm = 2x14 + 4x6 = 52°C Primer 2: GCTGTCCAGTCCATTGCTGT Tm = 2x9 + 4x11 = 62°C For at undgå uspecifik annealing til template og dermed risiko for uspecifikke produkter er det vigtigt at vælge forward og reverse primere med Tm værdier tæt på hinanden. Molekylærbiologi og genetik, F2008, S4 net HILS/BBLA, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen

PCR-maskine (thermal cycler) En PCR reaktion foregår typisk i et 0,2 ml plastic rør eller en micro-titer plade, som placeres i PCR-maskinens varmeblok. PCR-maskinen er nu i stand til lynhurtigt at veksle varmeblokkens temperatur mellem de tre niveauer: denaturering  annealing  extension  denaturering  etc., hvilket er forudsætningen for en effektiv PCR. Molekylærbiologi og genetik, F2008, S4 net HILS/BBLA, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen