Cytogenetik Cytogenetiske analyser (banding teknik, FISH) og karyotype

Præsentationer af emnet: "Cytogenetik Cytogenetiske analyser (banding teknik, FISH) og karyotype"— Præsentationens transcript:

1 Cytogenetik Cytogenetiske analyser (banding teknik, FISH) og karyotype
Kromosomabnormaliteter (numeriske og strukturelle) Genvej til karyotyper Gå direkte til dette Denne præsentation omhandler de genetiske ændringer, som kan ses på kromosomniveau; det vil traditionelt være ændringer, som påvirker store områder af arvemassen. Eksempelvis når dele af kromosomer deleteres, så hele gener forsvinder fra arvemassen, eller når der sker brud på kromosomerne og kromosomerne efterfølgende sættes forkert sammen. Kromosomabnormalitet er en forholdsvist hyppig årsag til genetiske sygdom, forekommende i ca. 1/150 nyfødte, og årsag til ½ af alle spontane aborter i 1. trimester. Studiet af kromosomer og deres abnormaliteter kaldes cytogenetik. En karyotype er det samlede kromosomsæt i en celle Indledningsvis skal siges, at opdelingen af ændringer i arvemassen i som værende enten på kromosomniveau eller på enkelt genniveau med tiden er blevet mere kunstig, fordi man med de nyeste teknikker kan identificere enkelt-gen mutationer med cytogenetiske metoder. Før vi beskæftiger os med kromosomabnormaliteterne præsenteres hvordan hele og/eller dele af kromosomer synliggøres ved farvning eller in situ hybridisering, herunder hvordan en normal karyotype ser ud. I præsentationen henvises til figurer fra lærebøgerne Medical Genetics og Molecular Diagnosis (på pensum listen benævnt MD og MG), hvorfor det er en god ide at have disse ved foran sig. Lyden aktiveres for hvert side ved at klikke på lyd ikonet nederst til højre Molekylærbiologi og genetik, 2008, S4 net Birte Bunch Larsen, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen

2 Cytogenetiske analyser: nogle indikationer
Diagnosticering af fænotypisk abnormalitet (fx hos nyfødt) Risikovurdering af forældre til nyfødt med fænotypisk abnormalitet med henblik på senere graviditet Prenatal diagnostik, herunder undersøgelse for Downs syndrom, samt undersøgelse for arvelige sygdomme som fx DiGeorge syndrom og Williams syndrom Cancer; fx leukemier med henblik på klassifikation, prognose og behandlingsregime Her er kort listet nogle almindelige årsager til at udføre cytogenetiske analyser. Det ses, at årsagerne kan spænde vidt lige fra at kontrollere kromosomantal (i Downs syndrom) og cancer, til at undersøge for deletioner af enkelte gener som fx elastin i Williams syndrom. Hvilke cytogenetiske analyser der udføres, samt disses design, afhænger bla af om den cytogenetiske abnomalitet er ukendt ( som ved punkt 1) eller kendt som ved de arvelige sygdomme i punkt 2. Traditionelt udføres cytogenetiske analyser på Klinisk biokemisk afdeling, klinisk genetisk afdeling og kliniske hæmatologiske afdelinger. Molekylærbiologi og genetik, 2008, S4 net Birte Bunch Larsen, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen

3 Cytogenetiske analyser: fakta om kromosomers opbygning og organisering, som udnyttes ved cytogenetisk analyse Fakta: et kromosom består af et langt DNA molekyle (dobbelt strenget), som er oprullet omkring histoner og andre proteiner. (figur 2.4 i Medical Genetics) → Kromosomer kan synliggøres/analyseres ved at benytte farvning af DNA og/eller proteiner med histokemiske farvestoffer (herunder banding teknik) mærkede DNA fragmenter (prober) som genkender og hybridiserer til komplementære sekvenser i kromosomets DNA streng (in situ hybridisering) Fakta: kromosomerne er mere eller mindre kondenserede i løbet af cellecyklus. I mitosens metafase er kromosomerne maximalt kondenserede, og kan ses lysmikroskopisk ved HE farvning, mens de i interfasen cytologisk fremstår som eukromatin (lyse områder i kernen) og heterokromatin (mørke områder). I interfasen er de enkelte kromosomer dog lokaliserede i kerneområder. → Metafase kromosomer fra celler i deling kan anvendes til at beskrive en persons samlede kromosomudseende, kaldet karyotypen, mens interfasekromosomer kan anvendes til analyser, hvor man leder efter en bestemt mutation. Ved cytogenetisk analyse udnyttes, at alle kromosomer består af et velordnet DNA molekyle og forskellige proteiner associeret med forskellige områder. Det betyder, at kromosomerne kan synliggøres histokemisk vha farvestoffer som fx Giemsa farve. Forskellige områder af DNA molekylet (og dermed kromosomet) kan også synliggøres ved hybridisering af sekvensspecifikke prober til udvalgte områder i DNA molekylet. Denne in situ hybridisering tilsvarer hybridisering som set i Southern blot proceduren. Et andet fakta er, at kromosomernes grad af kondensering varierer i løbet af cellecyklus, således at enkelte kromosomer faktisk kan ses lysmikroskopisk i metafasen, mens kromatin i interfasen fremstår som eukromatin og heterokromatin. Eukromatin formodes at repræsentere transkriptionsaktivt DNA med få associerede proteiner, mens heterokromatin repræsenterer mindre aktivt DNA med flere associerede proteiner. Det betyder, at det samlede kromosomudseende hos en person – hvilket benævnes personens karyotype - kan beskrives ved analyse af metafase kromosomer, mens man ved undersøgelser, hvor man fx blot interesserer sig for om et kromosom er deleteret eller amplifiseret kan anvende interfasekromosomer. Analyser af interfasekromosomer er langt hurtigere, fordi cellerne efter prøvetagning ikke skal bringes i vækst og efterfølgende deling. Prøvematerialer til cytogenetisk analyse fremgår af næste slide. Molekylærbiologi og genetik, 2008, S4 net Birte Bunch Larsen, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen

4 Cytogenetiske metoder: Prøvemateriale (blod, væske og vævsprøver)
Prøvematerialet kan indeholde levende celler, som kan bringes til deling (fx blod, moderkagebiopsi) → metafase kromosomer kan frembringes kan bestå af celler uden eller med insignifikant delingsevne (fx andre væv end blod samt fixeret væv) → celler er i interfase, og kun interfase kerner ses Da fx cytogenetiske analyser med henblik på at bestemme en persons karyotype kræver analyse af metafase kromosomer, er det nødvendigt, at prøvematerialet indeholder levende celler, som kan bringes til deling og efterfølgende stoppes i metafasen. Dette gælder fx blod og væv fra moderkage eller rygmarv. På billedet ses kondenserede kromosomer fra en sprængt metafase kerne liggende mellem interfase kerner. Fremstilling af metafasekromosomer til cytogenetisk analyse er beskrevet på næste slide Hvis du vil se flere metafasekromosomer (farvet med Giemsa), interfasekerner samt hetero- og eukromatin i interfasekerner kan du klikke her Se billeder Billede fra ældre Abbotts præsentation: udlånt af U. Larsen, Abbotts Giemsa farvet præparat Molekylærbiologi og genetik, 2008, S4 net Birte Bunch Larsen, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen

5 Cytogenetiske analyser: Kort om fremstilling af metafase kromosomer
Vævsprøve med levende celler dyrkes i kultur timer (periferale leukocytter i blod), idet celledeling stimuleres med et mitogen (fx phytohæmaglutinin) Cellernes metafase blokeres med fx colcemid, som hæmmer mitotisk spindle dannelse. Cellerne(kernerne) høstes ved bl.a. centrifugering, og placeres på objektglas Hypotonisk saltvand får kernemembranen til at sprænges, så metafasekromosomerne spredes på objektglasset, og under lufttørring bindes til objektglasset. Kromosomerne visualiseres efter kromosom banding teknik eller FISH procedure, og fotograferes med henblik på karyotypering (karyotypebestemmelse) Følgende er en meget opverordnet fremstilling af, hvordan metafase kromosomer frembringes. Metafasekromosomer fremstilles fra væv (altså også blod) ved at dyrke cellerne i kultur i timer, og herefter stimulere celledeling med et mitogen (fx phytohæmaglutinin). De delende celler stoppes i metafasen med colcemid, som hæmmer den mitotiske spindle dannelse. Herefter skylles cellerne fra vækstpladen, vaskes, lyseres og centrifugeres, før suspensionen sættes på objektglas. Når metafase cellekernerne efterfølgende udsættes for hypotonisk saltvand sprænges cellekernerne, og kromosomerne spredes på objektglasset, hvor de lufttørres. Interfasekerner forbliver intakte som det sås på foregående link. Molekylærbiologi og genetik, 2008, S4 net Birte Bunch Larsen, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen

6 Cytogenetiske metoder: kort om kromosom banding teknik
Princip: forskellige områder af kromosomerne farves forskelligt af et givet farvestof, hvorved et karakteristisk båndmønster fremkommer på forskellige kromosom par. Ofte benyttes G banding, som fremkommer ved farvning med Giemsa farve efter trypsinbehandling (MG fig. 6.3). Vha båndmønstre kan man identificere præcise dele af kromosomerne til brug ved karyotypering; fx 7q12.2 (pil) Subbånd Bånd Region Arm 3 2 1 2 2 2 1 1 p 5 4 3 2 1 1 1 1 2 3 1 1 q 1 2 3 2 Kromosom banding udføres rutinemæssigt på metafase komosomer ved cytogenetiske undersøgelser, og er ofte udgangspunktet for karyotypering. Princippet er, at forskellige områder af kromosomes farvet forskellige afhængigt af indholdet af DNA og forskellige proteiner. Kromosomerne kan farves med forskellige farvestoffer, som alle giver et karakteristisk mønster for de enkelte kromosomer. Oftest anvendes Giemsa farvning efter behandling med trypsin, fordi dette resulterer i mange distinkte og reproducerbare bånd. Jeg har forsøgt at illustrere dette til højre på figuren for det submetacentriske kromosom 7, hvis DNA dels kan opdeles i p (petite=kort) og q arm, som igen begge kan kan opdeles i 2 regioner(halvdele), som igen underopdeles i band og subbånd. Båndmønstrene anvendes direkte til en detaljeret beskrivelse af karyotypen. 1 2 3 4 1 1 2 3 2 2 Kromosom 7; G banding teknik Molekylærbiologi og genetik, 2008, S4 net Birte Bunch Larsen, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen Tilbage til karyotyper

7 Cytogenetiske analyser: karyotype og karyotypering
Karyotype: en ordnet præsentation af et individs metafase kromosomstruktur baseret på en celles metafasekromosomer arrangeret efter størrelse og centromér placering. Kønskromosomer placeres nederst til højre. (se MG fig. 8-8, MD fig. 6.1) Karyotypering: navn for den proces, hvorved et individs karyotype fremkommer. Karyotypering kan ske på baggrund af kromosom banding teknik og/eller flourescens in situ hybridisering (FISH). Karyotypen angives i henhold til international standard nomenklatur. Den cytogenetiske analyse udmunder i en cytogenetisk diagnose, som oftest er en standardiseret beskrivelse af personens samlede kromosomudseende på baggrund af karyotypering. Karyotypering kan beskrives som den proces, hvorved man udreder en persons karyotype. Karyotypen er en ordnet præsentation af et individs metafase kromosomstruktur baseret på en celles metafasekromosomer arrangeret efter størrelse og centromér placering. Kønskromosomer placeres nederst til højre. (MG fig. 8-8, MD fig. 6.1). Karyotypering sker ofte rutinemæssigt på baggrund af kromosom banding teknik, men kan også laves med in situ hybridisering. Karyotypen angives altid i henhold til internaltionale retningslinier Til dette Til dette Til start Molekylærbiologi og genetik, 2008, S4 net Birte Bunch Larsen, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen

8 Cytogenetiske analyser: Karyotypering i praksis
20-30 metafaser tælles 10-25 af disse karyotyperes; dvs opsættes som vist i MG figure 6.1 og figure 6.7 Kromosomerne tælles (parres) og båndene analyseres Cytogenetisk diagnose afgives (ISCN) I praksis nøjes man ved en cytogenetisk analyse ikke med at bestemme karyotypen i én celle; den angives altid på baggrund af flere analyserede celler. Hvormange celler der tælles/analyseres kan variere afhængigt af metoden og materialet. For cytogenetiske analyser tælles metafaser objektglasset, og på baggrund heraf karyotyperes metafaser, dvs. opsættes i orden efter størrelse osv. som vist på figuren. Figur fra Abbotts præsentation: udlånt af U. Larsen, Abbotts Tilbage til strukturelle abnormiteter Molekylærbiologi og genetik, 2008, S4 net Birte Bunch Larsen, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen

9 Cytogenetiske analyser: International standard cytogenetisk nomenklatur(ISCN)
Se MD tabel 8.3 for liste over forkortelser Se MG tabel 6.1 for eksempler Generelt angives (Kromosom antal pr. celle), (kønskromosomer), (alle observerede abnomaliter) Se eksempler i MG figur 8-10 og 8-12, eller tag en slapper og leg lidt med karyotyper: I lærebøgerne er givet flere eksempler på karyotyper ved anvendelse af international standard for cytogenetisk nomenklatur. Man skal holde tungen lige i munden, men der er også simple regler. Fx angives altid først antallet af kromosomer, herefter kønskromosomerne, og tilslut alle de observerede abnormaliteter med anvendelse af internationale forkortelser. Fx t for translokation, del for deletion osv. Hvis du har fået lyst til selv at karyotypere, kan du klikke på knappen karyotypering, og gå til en interaktiv side. Præsentaionen her fortsætter med en gennemgang af fourecens in situ hybridisering. (Hvis Eigils billeder med: På næste side ses dels billede af spredte metafase kromosomer og en ordnet opsætning efter inernationale regler. Prøv selv at karyotypere…..) karyotypering Molekylærbiologi og genetik, 2008, S4 net Birte Bunch Larsen, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen

10 Cytogenetiske metoder: kort om flourescens in situ hybridisering (FISH)
Forskellige områder på et kromosompar eller forskellige kromosompar farves afhængigt af hvilken fluoroscerende probe, der vælges til hybridisering. Almindelige er: Centromer prober (CEP) og telomer prober (TEP) (korte ~5 kb): hybridiser specifikt til henholdsvis centromeret og telomeren på et kromosom, og er kromosomspecifikt. Locus specifkke prober: korte ( kb) prober, som genkender sekvenser i fx et gen Kromosomprober: dækker hele kromosomer (prober op til 40 Mb) Resultat af farvningen ses ved flourescensmikroskopi. Som du måske selv har erfaret kan det være ret svært at aflæse G bånd præcist – selv for en erfaren cytogenetiker; fx kan identifikation af ændinrger som medfører flytning (translokation) af kromosomdele fra et kromosom til et andet være svære at karyotypere, eller ændringer inde i et bånd. Her kan DNA strengenes sekvenser anvendes, idet de er specifikke nok til, at der lave laves flouroscens mærkede prober for forskellige områder af DNA strengen. Farven på området afhænger af, hvilket flourogen proben mærkes med. Typisk anvendes prober, som er kromosom specifikke, idet de hybridiserer til repeterede sekvenser i kromosomets centromer eller telomer. Disse prober er forholdsvist korte, og anvendes især når man vil tælle kromosom antal. Hvis man derimod fx vil tælle antallet af et gen bruges lokus specifikke prober. For at identicere hele kromosomdele anvendes kromosmprober, som dækker alle sekvenser af et kromosom. I alle tilfælde ses resultatet af analysen ved flourescensmikroskopi, og analysesvaret skal relativt hurtigt aflæses, da fourescens i modsætning til Giemsa farven falmer (selv ved opbevaring i køligt mørke) FISH analyse kan udføres på både interfase kerner og metafasekromosmer, afhængigt af analysens formål. Ulemper/fordele (interfase: dyrkning kræves ikke, mange kerner skal gennemses) Molekylærbiologi og genetik, 2008, S4 net Birte Bunch Larsen, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen

11 Cytogenetiske teknikker: Sammenligning af Geimsa bånd og FISH signaler
Her ses det samme præparat farvet med Giemsa og med FISH ved brug af en lokusspecifik probe for HER-2 genet (som ofte er amplificeret I mammacancer) og en centromer specifk probe for kromosom 17, hvorpå HER-2 genet sidder. Andet DNA er farvet med DAPI. Bemærk at man ved anvendelse af disse relativt korte prober, hvor formålet er at afgøre tilstedeværelse eller ej af et givent gen eller kromosom, får samme resultat ved at anvende interfasekerner og metafasekromosomer. Først nævnte er blot langt hurtigere at analysere, fordi cellerne ikke skal dyrkes først, og analysen er mere sensitiv, fordi flere kerne hurtigt kan tælles. Tilgengæld er det nemmere at separer signalerne på metafasekromosomer. G-bånd LSI HER-2/neu CEP 17 Begge figurer fra Abbots præsentation om FISH; udlånt af U. Larsen. Bemærk, at FISH kan anvendes diagnostisk på både interfasekerner og metafasekromosomer Molekylærbiologi og genetik, 2008, S4 net Birte Bunch Larsen, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen

12 Cytogenetiske teknikker: Princippet bag FISH
Figuren er en illustration af princippet bag FISH teknikken. Princippet baserer sig som i Southern blot helt basalt på, at mærkede prober kan hybridisere til længere DNA molekyler, som indeholder en komplementær sekvens - forudsat naturligvis, at der er tale om enkeltstrenget DNA. Øverst mpd venstre ses et dobbelstrenget DNA molekyle, som mærkes med et fluorescerende farvestof. Den dobbeltstrengede DNA probe denatureres, så den bliver enkeltstrenget. I midten ses et dobbeltstrenget DNA molekyle, som er placeret i et metafase kromosom. Dette DNA molekyle, som altså er del af kromosomet på objektglasset, er denatureret (i en opløsning med formamid og detergent) på forhånd, således at den fluorescerende probe kan hybridisere til sin komplementære sekvens. Signalet fra den hybridiserede probe er som sagt direkte synlig i et fluorescensmikroskop både på metafase kromosomer og interfasekromosomer FISH anvendes ofte som supplement til den kromosom banding baserede cytogenetiske karyotypering, men FISh anvendes også rutinemæssigt til at undersøge prenatale prøver for fx Downs syndrom, ved hæmatologiske analyser, hvor specifkke ændringer af arvemassen har betydning for valg af behandling og prognose. Figur lånt fra ældre Abbots præsentation; efter aftale Tilbage til karyotyper Molekylærbiologi og genetik, 2008, S4 net Birte Bunch Larsen, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen

13 Kromosomabnormaliteter: typer og hyppighed
Abnormt kromosomantal (benævnes også genom mutationer eller numeriske abnormaliteter) eller Abnorm kromosomstruktur (benævnes også kromosom mutationer eller strukturelle abnomaliteter) Hyppigheder for nogle af disse ses i MG tabel 6.2 Nu skal vi så beskæftige os med de forskellige typer af kromosomabnormaliteter, hvoraf nogle allerede er indirekte nævnt i det foregående. Kromosomabnormalitet er som sagt indledningsvist hyppig årsag til genetisk sygdom, forekommende i ca. 1/150 nyfødte, og årsag til ½ af alle spontane aborter i 1. trimester. De kan overordnet opdeles i to klasser; abnormaliteter med abnormt kromosomantalsamt abnorm kromosom struktur Hyppigheden af forskellige abnormaliteter hos nyfødte kan ses i MG tabel 6.2. Mange abnormaliteter er dog ikke forenelige med fuldbårnet liv, og selv hos de levedygtige nyfødte medfører kromosom abnormaliteter ofte mental retardering, forøget mortalitet (dødelighed) og infertilitet. Mange cancertyper har ustabile kromosomer og abnormale mitoser, hvorfor både numeriske og strukturelle kromosomabnormaliteter ofte forekommer i cancerceller. Til start Molekylærbiologi og genetik, 2008, S4 net Birte Bunch Larsen, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen

14 Kromosomabnormaliteter: Numeriske abnormaliteter
Normalt: - Euploid (2 x 23 i mennesket: 2N), - Haploid (antal i kønsceller; 23 hos mennesket: N) Abnormalt: - Polyploidy (3, 4, eller … x 23: fx 3N) - Aneuploidy (færre eller flere kromosomer end et multiple af 23; fx 2N-1 eller 2N+1) De numeriske abnormaliter er afvigelser fra det normale kromosom antal; dvs det euploide kromosomantal, som hos mennesket er 2 x 23 kromosomer, eller sagt på en anden måde 2 x det haploide kromosom antal, som er antallet af kromosomer i kønscellerne. Det haploide kromosomantal angives ofte som N. Vi taler om, at mennesket har 23 kromosompardvs 2N, hvoraf det ene kromosom i hvert par er fra moderen, mens det andet er fra faderen. Den maternelle eller paternelle oprindelse af de to kromosomer i et par kan ikke umiddelbart skelnes ved karyotypering (medmindre man har lavet karyotyper for forældrene, og fundet abnormaliteter, som er nedarvet). Hvis antallet af kromosomer i et individs celler er forøget, så der observeres flere hele sæt kromosomer end 2; dvs 3, 4 eller flere, benævnes tilstanden polypoidy. Polyploidy i form af triploidy eller tetraploidy ses meget sjældent, og er normalt uforeneligt med liv. Tilstandene kan opstå ved dobbeltbefrugtning, fusion af to zygoter (2 befrugtede ægceller) eller pga meiotiske fejl, ofte som nondisjunction. Nondisjunktion forklares på en senere slide. Hvis der ses flere eller færre kromosomer end to i et eller flere kromosompar er der tale om aneuploidy. Molekylærbiologi og genetik, 2008, S4 net Birte Bunch Larsen, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen

15 Kromosomabnormaliteter: Numeriske abnormaliteter - aneuploidy
Oftest monosomi eller trisomi af ét kromosompar Autosomer eller kønskromosomer monosomi: monosomi: oftest letal i forstertilstanden 45,X (Turner syndrom) trisomi: trisomi: især 47,+21; 47,+18; 47,+13 47, XXY; 47, XXX; 47XYY Skyldes oftest meiotisk nondisjunction, men kan også ske i mitosen Oftest er der ved aneuploidy kun tale om, at ét kromosompar mangler et kromosom (monosomi) eller har et for meget (kaldes trisomi). Aneuploidy kan ses for både autosomer og kønskromosomer. Her er givet nogle eksempler på forskellige aneuploidyer. Aneuploidy skyldes oftest meiotisk nondisjunktion i meiosen eller mitosen. Hvis nondisjunktion sker i en mitose i et foster kan individet være mosaik mht kromosmabnormaliteten. Molekylærbiologi og genetik, 2008, S4 net Birte Bunch Larsen, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen

16 Kromosomabnormaliteter: meiotisk nondisjunction
Se MG figure 6.6 På venstre side sker nondisjunction i 1. meiotiske deling Til højre sker nondisjunction i 2. meiotiske deling ▬► Dannelse af kønsceller, som ved befrugtning med en normal kønscelle vil resultere i monosomi eller trisomi hos afkommet Meiotisk nondisjunction betyder, at de 4 kromatider i et metafase kromosom par i adskilles og fordeles til hver sin kønscelle efter meiosen. Nondisjunktion kan ske i enten 1. eller 2. meiotiske deling, hvilket er illustreret på figur 6.6 i MG. Figuren viser kun situationen i msiosen for ét kromosompar – I må forestille jer, at de andre kromosompar også er tilstede, og fordeles som normalt i meiosen. På venstre side af…. Nondisjuntion af autosomerne sker især i maternale kønscelleforstadier, og sker hyppigere med stigende alder; specielt efter 35 år. Det betyder, at de fleste autosomale trisomier har deres ekstra kromosom fra moderen. Årsagen til den maternelle aldersafhængige nondisjunktion antages at være den hunlige kønscelledeling; oogenesen, hvor kønscellerforstadierne hviler midt i profase 1 i op til 45 år; dvs fra fødsel til befrugtning af det aktuelle æg. Nondisjunction af kønskromosomer synes derimod at finde sted nogenlunde lige ofte i mænd og kvinder. Dette skyldes måske den asymmetriske parring af de to uens store kønskromosmer under den mandlige kønscelledannelse, kaldet spematogenesen Molekylærbiologi og genetik, 2008, S4 net Birte Bunch Larsen, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen

17 Kromosomabnormaliteter: Screening for aneuploidy
i fostervand, moderkagebiopsi eller blod 13 (green), 21 (red) disomy 13 X (green), Y (red) 18 (aqua) På denne side ses, hvordan de hyppigst forekommende trisomier, nemlig autosomal trisomi 21, 13 og 18 kan påvises med interfaseFISH teknik i celler fra fostervand, moderkagebiopsi eller blod. Fordelen ved interfaseFISH i forhold til en rutine cytogenetisk undersøgelse og beskrivelse af hele karyotypen er naturligtvis, at den er langt hurtigere, da cellerne ikke skal dyrkes før analysen. I tilfælde af monosomi ville man naturligvis blot se ét signal, hvor der burde have været to; fx for kønskromosom X monosomi, hvor kun et x signal ville ses i stedet for et x og et y eller to x signaler. trisomy 21 Billeder udlånt af overlæge Carsten Brandt Molekylærbiologi og genetik, 2008, S4 net Birte Bunch Larsen, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen

18 Kromosomabnormaliteter: strukturelle abnormaliteter
Typer: - Translokation (reciprok og i praksis robertsonsk) Balanceret - Inversion - Deletion - Duplikation Ubalanceret - Ring kromosom - Translokation (ikke gensidig udveksling) Årsager: upræcis parring af kromosomer i meiose samt kromosombrud i meiose og mitose (sker ofte i ”hot spots”) Se tidligere eksempel Se IFISH detektion Her ses de forskellige typer af strukturelle kromosom abnormaliter. Translokation ses, når der er sket udveksling af genetisk mateirale mellem ikke homologe kromosomer. Du har tidligere set eksempler på translokationer påvist med metafase og interfase FISH analyse i denne præsentation. Fx en translokation mellem kromosom 9 og 22. Du kan klikke for at se dette eksempel igen Inversion forekommer indenfor et kromosom, og skyldes brud på kromosomet, hvorefter det frigjorte stykke er sat ind på det oprindelige kromosom, men i omvendt orientering. Deletion er tab af et stykke af et større eller mindre kromosomstykke, og dermed tab af genetisk materiale. Det kan være sket terminalt – altså at enden er tabt- eller intersitialt, hvor et stykke midt på kromosomet mangler. Syndromer pga autosomale deletioner er de hyppigst forekommende strukturelle kromosom abnormaliteter. Et eksempel er ”katteskrigssyndromet”, hvor den distale del af p armen på kromosom 5 er deleteret. Mikrodeletioner er små deletioner under 5 Mb, som er sværre eller umulige at se ved kromosom banding teknik. Et godt eksempel på mikrodeletions udløst syndrom er prader-Willi syndromet, som ofte skyldes en lille deletion i kromosom båand 15q11-q13. Du kan se et eksempel på detektion af Prader Willi deletionen ved at klikke på knappen I modsætning til deletioner ses duplikationer, når et kromosmstykke er blevet amplificeret og derfor findes i flere kopier end to i genomet. Duplikationer giver sjældent så store konsekvenser for bæreren som deletioner, hvilket understreger, at tab af genetisk materiale er værre end at have formeget genetisk materiale. Sikkert fordi cellerne har mekanismer til at lukke overskydenede gener ned med. I visse cancertyper (fes mammacancer) har man fundet, at duplikationer af bestemte gener giver forøget respons på nogle behandlinger, hvorfor identifiaktion med FISH af disse duplifikationer nu indgår som rutine ifht behandlingsvalg Endeligt forekommer ringkromosomer, som opstår efter tab af telomert materiale på begge ender af en kromosom, hvorefter kromosomets to ender klstrer sammen. Ringkromosomer er sjældne, fordi de oftest tabes, hvilket resulterer i monosomi i disse celler. Årsagerne til de strukturelle abnormalitet skal findes dels i upræcis parring af kromosomerne ved meiose, samt ved kromosombrud, som forekommer under både meiose og mitose. Upræcisparring og brud sker med højere hyppighed i nogle dele af kromosomerne en andre. Disse områder kaldes hot spots, og kan fx være områder med repeteret DNA. Molekylærbiologi og genetik, 2008, S4 net Birte Bunch Larsen, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen

19 Kromosomabnormaliteter: mikrodeletion detektion med mFISH
Prader-Willi Syndrome (PWS) del(15)(q11.2q11.2)(SNRPN-) normal 15 Chr. 15 centromere signal locus 15q11.2 signal control signal Tilbage Molekylærbiologi og genetik, 2008, S4 net Birte Bunch Larsen, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen Billede udlånt af overlæge Carsten Brandt

20 Kromosomabnormaliteter: Strukturelle abnormaliteter handler også om balance
Balancerede x ubalancerede Ex. MG figur 6.14 og Ex. Prader Willi syndrom (6.16) Oftest altid forbundet med sygelighed, retardering og øget mortalitet Ofte fuldt forenelige med et normalt voksenliv Nogle translokationer, altså ændringer, hvor der er sket udveksling af arvemassen mellem kromosmerne, er balancerede. Det betyder, at mængden af arvemateriale er den samme som i et normalt genom, men altså strukturelt fejlplaceret. Dette gælder reciprok translokation, hvor der er sket en gensidig udveskling af arvemateriale mellem to kromosomer, og det gælder i praksis for robertsonske translokationer, hvor kun ubetydelige mængder af inaktivt arvemateriale er forsvundet. I modsætning hertil er ubalancerede translokationer, hvor et stykke af et kromosom er adderet til et andet kromosom, samtidigt med, at de oprindelige kromosomer er intakte – det svarer faktisk til et strukturelt betinget trisom for et kromosomområde. Det interssante er, at mens ubalancerede strukturellse kvomosmabnomaliteter altid giver symptomer i form af forskellige syndromer med nedsat, væst, mental retardering osv, er banlancerede translokationer oftest forenelig med et normalt voksenliv, således at bæreren af den balancerede translokation ofte først opdager denne ved cytogenetisk analyse som følge af at have fået et fænotypisk unormalt barn med en ubalanceret translokation. Studer figur 6.14 og 6.16 i MG, for at se hvorfor kromosomparringen i maiosen har så sværre vilkår for de bancerede individer, og hvorfor deres børn så ofte bliver bærere af ubalancede translokationer. Abnormal kromosom- parring i meiosen Abnormal kromosom- parring i meiosen Stor risiko for abnormale børn (MG 6.14, 6.16) Molekylærbiologi og genetik, 2008, S4 net Birte Bunch Larsen, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen