Agardiffusion Metode standardiseret af Swedish Reference Group for Antibiotics (SRGA) Antibiotikadiscs fra Oxoid Isosensitest medium A,B og C fra Oxoid Tilsåning med 1/100 McF 0,5. Medium og antibiotika udvalg er tilpasset bakteriefund. På KMA i Herning arbejder vi efter svensk standard. Derfor anvender vi som anbefalet af swedish reference group for antibiotics antibiotikadiscs og resistensplader fra firmaet Oxoid. Resistenspladerne findes i 3 udgaver svarende til A agarplade, B blodplade og C chokoladeplade. Inokulum skal være 1/100 McF 0,5. Dvs. der fremstilles en bakteriesuspension i fysiologisk saltvand med en turbiditet svarende til McF 0,5. Denne fortyndes efterfølgende med 1 dråbe svarende til ca. 50 ul i 5 mL saltvand. Altså en fortynding på 100 x. Hvilket medium der vælges og hvilke antibiotika der undersøges for afhænger af hvilken bakterie der skal resistensbestemmes. Dvs. vi i Herning først udfører resistensbestemmelsen når vi har identificeret bakterien. En undtagelse er dog urindyrkning, hvor vi med forventning om at finde enterobakterier udfører resistensbestemmelse direkte fra urinprøven.

Agardiffusion Faktorer af betydning for resultatet: Substratet Bakterielle faktorer Antibiotika relaterede faktorer Apparatur Menneskelige faktorer Følgende faktorer har indflydelse på resistensbestemmelsen: Hvilket substrat der anvendes. Hvilken bakterie der skal resistensbestemmes Hvilke antibiotika der anvendes Evt apparatur, det kan fx være til udsåning af bakterien, til aflæsning af hæmningszone. Personalet der udfører resistensbestemmelsen

Substratet Standardiseret medie Næringsmængde understøtter god vækst Agartykkelsen. OBS korrekt opbevaring. pH påvirker bakterievækst og har ofte stærk indflydelse på antibiotikaeffekt. Testet med ATCC stammer overfor en række antibiotika Substratet skal være standardiseret og der skal være et kvalitetscertifikat: Af dette certificat skal mediets næringsindhold fremgå, pladetykkelse, pH samt hvilke bakteriestammer mediet er testet for før levering. Næringsmængden i pladen skal understøtte god vækst af bakterien. Agartykkelsen er vigtig at bevare hvilket fremgår af næste billede. Dette opnås ved at opbevare pladen korrekt v. 4 grader og ved ikke at anvende plader med overskreden holdbarhedsdato. Ph værdien er vigtig da den både har indflydelse på bakterievæksten og ofte også på antibiotikas effekt. ATCC står for American Type Culture Collection som er veldefinerede og gennemtestede bakteriestammer man kan købe og anvende til kvalitetskontrol. Således er det vigtigt at anvende kvalitetskontrollerede medier, hvor ATCC stammerne har givet det forventede resultat på mediet.

Agartykkelsens betydning Dette billede illustrerer betydningen af agartykkelsen. Øverst ses en plade med korrekt tykkelse. Her diffunderer antibiotika fra discen frit ud i mediet Nederst ses en for tynd plade fx pga forkert opbevaring. antibitikamolekylerne vil ramme bunden af pladen og derefter diffundere længere ud i mediet resulterende i en falsk forstørret hæmningszone

Bakterielle faktorer Bakteriens følsomhed, medfødt/erhvervet resistens Lagfasens længde Bakteriestammens væksthastighed, hurtig vækst => lille hæmningszone Bakteriers vækstkurver er forskellige. Lagfasens længde er forskellig og væksthastigheden er forskellig. Når en bakterie skal resistensbestemmes prøver vi at tilpasse forholdene til den aktuelle bakterie mht. valg af medie og inkubationsforhold. En bakterieart kan desuden have kendte resistensmekanismer. Dette tages der forbehold for i det antibiotikaudvalg bakterien vælges undersøgt for.

Antibiotika Antibiotikadepot; OBS opbevaring, minus fugt, holdbarhed Antal disc i forhold til næringsmængde. Evne til at diffundere ud i agar (stort molekyle => lille zone) QC-certifikat. Afpasses bakteriefund Et antibiotikadepot vil sige en papirdisc eller en tablet indeholdende antibiotika.I Herning bruger vi antibiotikadisks og for hvert lotnr findes kvalitetscertifikater, hvoraf kvalitetssikringen af produktet fremgår. Det er vigtigt at opbevaringen er korrekt. For diskenes vedkommende skal de opbevares v. 4 grader. Det er også vigtigt at de ikke får fugt. Derfor opbevares de i beholdere med tørremiddel. Det er vigtigt at der ikke lægges for mange disks eller tabletter på hver plade. Antallet skal tilpasses den næringsmængde, som er i pladen. De fremkomne zonestørrelser vil også afhænge af antibiotikaets molekylestørrelse. Fx Vancomycin er et antibiotika med meget stor molekylstørrelse. Det betyder at det diffunderer langsomt ud i mediet og der opstår kun en lille hæmningszone selvom bakterien er følsom for midlet. Som nævnt tidligere vælges der at undersøge for antibiotika ift. hvilket bakteriefund der er gjort.

Inkubation Korrekt temperatur og evt. atmosfære (OBS inkubator). Undgå for høje stakke af plader. (temperatur). Tid fra tilsåning til antibiotika lægges på. Tid fra pålægning til inkubation. Inkubation 16 – 20 timer. Det er selvfølgelig vigtigt at inkubatorerne tjekkes dagligt for korrekt temperatur og evt. atmosfære (fx ekstra CO2 eller anaerobe forhold) Når pladerne skal inkuberes bør det ikke ske med mere end 5 ovenpå hinanden. Ellers går der for lang tid før pladerne får den rette temperatur. Ifølge den svenske standard må der max. Gå ½ time fra pladen er tilsået til antibiotika lægges på. Derefter skal der gå ½ til 1 hel time inden pladen inkuberes. Dermed får antibiotika et lille forspring med at diffundere ud i pladen før bakterien kommer i vækst. Pladen inkuberes derefter 16 - 20 timer.

Zonedannelse og tid Antibiotikakonc. i agaren Disk kant (Penicillin) 5 10 15 20 Antibiotikakonc. i agaren Disk kant (Penicillin) Hæmningszonediameter i mm 30 mm Efter 2 t Efter 4 t Efter 6 t Efter 8 t På dette billede ses hvorledes antibiotika diffunderer fra antibiotikadepotet ud i mediet over tid.

Menneskelige faktorer Populationer? (tag fra 5 kolonier) Tilsåningskvalitet Standardisering af inokulum Aflæsning (hvordan og hvor aflæses zonediameteren/radius) Kendskab til resistensmekanismer Løbende oplæring/videreuddannelse Kvalitetskontrol Nå resistensbestemmelsen skal udføres er det bedst at tage fra en renkultur. Er dette ikke muligt er det vigtigt at de rigtige kolonier ligger isoleret og let genkendelige på pladen. Der bør tages fra mindst 5 kolonier for at undgå at ramme en enkelt mutant som ikke er repræsentativ for undersøgelsen. inokulum skal være standardiseret med det formål at bakterierne skal ligge skulder ved skulder – også kaldet semikonfluerende vækst. Aflæsning af zonestørrelsen foretages med skydelære og det er vigtigt at vide hvor zonegrænsen skal aflæses for at være korrekt. Aflæsning skal foretages af bioanalytikere med kendskab til resistensmekanismer og som løbende videreuddannes i resistensbestemmelse. Bioanalytikerne skal endvidere foretage kvalitetskontrol af undersøgelsen.

Semikonfluerende vækst På dette billede fremgår det hvordan semikonfluerende vækst ser ud. Det er vigtigt at opnå en tæthed der ligner denne for at opnå korrekte hæmningszoner

Aflæsning agardiffusion Zonestørrelser aflæses i mm med skydelære OBS: Bakterieslægt/-art OBS: Strandbred/klippekant OBS: Indikatorantibiotika Zonestørrelse relateres til SRGA’s breakpoints Oversættes til S, I eller R zonestørrelserne aflæses med en skydelære. Når zonestørrelserne skal tolkes til S følsom, I intermediær eller nedsat følsom og R resistent i henhold til SRGA’s breakpoints er det vigtigt at kende bakterieslægten og i visse tilfælde også arten. For visse antibiotika og bakteriearter skal man være opmærksom på om der er dannet strandbred eller klippekant, hvor zonen ophører. Det gælder fx for stafylococcer og penicillin. I visse tilfælde anvendes et indikatorantibiotika i stedet for det antibiotika som skal med ud på svaret. Det skyldes at det kan være nemmere at påvise resistens in vitro med et andet antibiotika end det der skal behandles med. Fx undersøges methicillin resistens hos stafylokokker med cefoxitin.

Zonestørrelser angives i mm som zonens diameter Zonestørrelser angives i mm som zonens diameter. Det er dog ikke altid muligt at måle diameteren og så må man måle radius og gange med 2.

Zonestørrelse? 80 % hæmning Dette billede viser en strandbred hvor væksten af bakterien stimuleres bedre og bedre jo større afstand der er til antibiotikadepotet. Da det kan være ganske få mm’s forskel der afgør om en bakterie er følsom eller resistent er det vigtigt at måle zonestørrelsen i henhold til standarden. Den øverste streg viser hvor der er 100 % vækst og den nederste hvor væksten er 100% hæmmet. Zonestørrelsen skal i henhold til den svenske standard aflæses ved 80% hæmning som vist med den gule streg. Det skal bemærkes at andre standarder bruger 50% hæmning.

Klippekant Her ses en Stafylokok aureus som er resistent for penicillin på trods af zonen. Seleve zonestørrelsen er i dette tilfælde ikke interessant, da der er dannet klippekant, som i dette tilfælde indikerer at bakterien er resistent.

Svar på en urindyrkning På et svar på en resistensundersøgelse fremgår hvilke antibiotika bakterien er henholdsvis følsom for, nedsat følsom for og resistent for. Det tilstræbes altid at give et svar hvor der er valgmuligheder for behandling.