Temadag om kropsvæsker: 9. November 2012. Tælling af celler i div. kropsvæsker – og differentialtælling. Margit Grome, afdelingsbioanalytker, KB 3011 Klinisk Biokemisk afd. KB3011

Antal og type af BF’s på KB 3011 i 2011: CSV: 3050 ASC: 303 Ledvæsker: 2 Pleura: 50 I alt: 3405 Dvs. gennemsnit per uge: 66 Vi kan også have enkelte pericardie-væsker ( 3- 5 / år). Klinisk Biokemisk afd. KB3011

Hvad har vi hidtil gjort (tælling af celler i kropsvæske (BF): Celletælling: I CSV tælles rutinemæssigt RBC og WBC I andre BF’s tælles kun WBC Nedre detektionsgrænse: WBC : 3 x 106/l og RBC: 1 x 106/l Øvre svargrænse: WBC: 40.000 x 106/l, RBC: 200.000 x 106/l Klinisk Biokemisk afd. KB3011

Hvad har vi hidtil gjort (tælling af celler i kropsvæsker (BF): Celletælling: Gode gamle tællekammermetode Tællekammer: Fuchs Rosenthal Velopblandet BF oplægges ufarvet – eller farvet med leukocyttællevæske (Methylvioleteddikesyre). Celler tælles i mikroskop. Evt. fortyndes. Man skal helst op på at tælle 200 celler (Hvis man kan…). Hvis RBC >2400 x 10^6/l kan Sysmex KX21 benyttes. Klinisk Biokemisk afd. KB3011

Hvad har vi hidtil gjort (Differentialtælling): Hvis leukocytantalskoncentrationen er > 10 x 106/l udføres altid differentialtælling. Oprettes automatisk af LABKA. Klinisk Biokemisk afd. KB3011

Vi blev i efteråret 2011 bekendt med at der var kommet et nyt hæmatologi-apparat: Sysmex XN med en interessant APP: Body Fluid (BF) mode ”Det måtte vi straks afprøve” Klinisk Biokemisk afd. KB3011

XN- Hvad er nyt mht Body Fluid ?? Lille mængde prøvemateriale. Prøvemængde: 88 µl. Min mængde – 160 µl el. 0,7 ml Større præcision: ”Extented count volumen”: 10,4 µl (WBC) (Fuchs Rosenthal indeholder 3,2 µl, Sysmex XE-5000: 2,4 µl) Fortynding: BF-WBC: 1: 20 (Blod 1 : 61) BF-RBC: 1:498 (samme som blod 1:498) Kontrolmateriale: BF-kontrol Klinisk Biokemisk afd. KB3011

Sysmex XN blev indstalleret og en arbejdsgruppe blev nedsat: 3 bioanalytikere ( Annette Holm, Ruth Deleuran og Bente Kofoed), 2 afdelingsbioanalytikere (Bente Barrit og Margit Grome) 1 underviser (Lone Sælsen) Opgave: analysering, indtastning og vurdering af data samt udformning af valideringsrapport. Klinisk Biokemisk afd. KB3011

Kontrolmateriale: XN CHECKTM BF Benyttes til kontrol af: Totalt antal kerneholdige celler (TNC), WBC,RBC og XN-diff-tælling af WBC. Består af: Stabiliserede humane RBC og WBC i et konserveringsmedie. 2 niveauer: Holdbarhed ef. åbning: 30 dage (v. 2 – 8 ºC) Forventede værdier: Anført på datablad /CD. Level 1 Level 2 WBC ca. 75 x 106/l ca. 300 x 106/l RBC ca. 25.000 x 106/l ca. 75.000 x 106/l Klinisk Biokemisk afd. KB3011

Indkøring af Kontrol: XN CHECKTM BF- på KB3011 Værdier for TC-BF (WBC) Data Level Lot nr. N middelværdi SD CV Target 1 2 QC-12971301 QC-12971302 20 21 81,4 x 106/l 299 x 106/l 3,30 9,51 4,1 % 3,2 % 77 x 106/l 293 x 106/l Klinisk Biokemisk afd. KB3011

Kontrolmateriale: XN CHECKTM BF- Værdier for TC-RBC Data Level Lot nr. N middelværdi SD CV Target 1 2 QC-12971301 QC-12971302 20 20 25100 x 106/l 74200 x 106/l 641 1795 2,6 % 2,4 % 24000 x 106/l 73000 x 106/l Klinisk Biokemisk afd. KB3011

Konklusion af kontrolmateriale Kontrolmaterialet virker robust og er nemt at arbejde med. Holdbarheden er fin. CV er acceptabelt og de indkørte middelværdier ligger i acceptabel nærhed af ”Target”. Vi kunne dog godt ønske os lavere værdier i level 1 TC-BF (WBC) , så vi kom nærmere referenceintervallet. Klinisk Biokemisk afd. KB3011

SYSMEX XN BF Eksempel på Scattergram for kerneholdige celler: WDF-kanal: SFL = Side floure-scent light SSC = Side scattered light. Klinisk Biokemisk afd. KB3011

Fra SYSMEX Xn manual: Klinisk Biokemisk afd. KB3011

Det hele lød lovende…MEN Første problem: Prøvetagningsrør. I mange, mange år er der benyttet Plast-spidsrør. Det anbefales at man benytter: Sarstedt-rør 62.558.201 ( ML: 5. Ø/mm, 15,3. L/mm : 57,) (PT. arbejder vi på at få afdelingerne til at tage CSV-prøven i Sarstedt-rør. Det er lykkedes i enkelte tilfælde.) Klinisk Biokemisk afd. KB3011

Måleområde WBC (TC-BF): Angivet af Sysmex: Øvre grænse: 10.000 x 106/l Nedre grænse: 0 x 106/l Egne us, WBC: 4 CSV-prøver med lav WBC-konc (<5 x 106/l) Hver prøve analyseret 10 gange. Middelværdi og SD (intraassay) beregnet. Detektionsgrænse er fastsat til 0 + 5SD. Konklusion: SD: 0,49 x 106/l, Vores nedre WBC-detektionsgrænse: 3 x 106/l Klinisk Biokemisk afd. KB3011

Måleområde RBC: Angivet af Sysmex: Øvre grænse: 10.000 x 106/µl Nedre grænse: 0,003 x 109/µl = 3.000 x 106/l Egne us: 6 CSV-prøver med lav RBC-konc (< 0,8 x 109/l) Hver prøve analyseret 10 gange. Middelværdi og SD (intramediær) beregnet. Research parameter RBC-BF” benyttes ( Herved opnås 1 decimal mere) Detektionsgrænse er fastsat til 0 + 5SD. Nedre RBC-detektionsgrænse: 300 x 106/l Klinisk Biokemisk afd. KB3011

70 prøver med WBC-konc: 0 – 1500 x 106/l Validering…. Metodesammenligning CSV- WBC tællekammermetoden vs.Sysmex XN. 70 prøver med WBC-konc: 0 – 1500 x 106/l (Enkelt høj prøve udeladt, resultat i mikroskop: 7219 x106/l, XN: 5405 x106/l) Acceptgrænse for gennemsnitlig spredning: 15% (relativt) for WBC > 20 x 106/l eller 3 x 106/l, for WBC < 20 x 106/l Yderl: 7 ascites og 1 pleura.. Klinisk Biokemisk afd. KB3011

Validering…. Metodesammenligning CSV- WBC tællekammermetoden vs. XN. Sæt A (WBC <1500 ) N=70 Sæt B (WBC <250 ) N=60 Method Comp.- Deming fit. Y= 0,94x + 7,8 Y= 1,16x – 2,7 Agreement- Altman Bland test Bias = -0,7 (95% CI: -20,9 til 19,4) Bias = 4,3 (95% CI: -1,1 til 9,6) Regerssion- Linear: R2 = 0,91 R2 = 0,93 Klinisk Biokemisk afd. KB3011

Validering…. Metodesammenligning CSV- WBC tællekammermetoden vs. XN Validering…. Metodesammenligning CSV- WBC tællekammermetoden vs. XN. WBC <1500 (n= 70) Klinisk Biokemisk afd. KB3011

Validering…. Metodesammenligning CSV- WBC tællekammermetoden vs. XN Validering…. Metodesammenligning CSV- WBC tællekammermetoden vs. XN. (WBC <250),( n= 60) Klinisk Biokemisk afd. KB3011

Alarmer ?? Ud af 70 prøver, var kun 1 behæftet med alarm: WBC abnormal scattergram. ( Res. WBC: 11 og 13 x 106/l) Så vi har ikke den store erfaring. Men vi har besluttet: Hvis * eller … vises til højre for data, er der stor usikkerhed = HÅNDTÆLLING. Hvis @ vises er måleområdet overskredet = FORTYND WBC abnormal scattergram = HÅNDTÆLLING Klinisk Biokemisk afd. KB3011

Validering…. Metodesammenligning CSV- WBC tællekammermetoden vs Validering…. Metodesammenligning CSV- WBC tællekammermetoden vs. Sysmex XN. Konklusion: Metoden opfylder de opstillede kvalitetskrav og instrumentet kan taget i brug. Klinisk Biokemisk afd. KB3011

Holdbarhed WBC: MHT Pleuravæske, Ascitisvæske og Ledvæske Prøvemateriale tages i – og opbevares i - EDTA-prøvetagningsrør. Tælles normalt straks efter modtagelsen.   Klinisk Biokemisk afd. KB3011

Opbevaring og holdbarhed: BF Opbevaring Holdbarhed CSV Rumtemp. 1time (udføres op til 3 timer m. kommentar) Pleura- Ascites- og ledvæske 4 timer Køl ( 2- 8 ºC) WBC: 24 timer DIFF: Holdbarhed er taget fra litteraturstudier: Barrett D. Conner: Variations in Pleural Fluid WBC Count and Differential Counts With Different Sample Containers and Different Methods. (CHEST 2003; 123:1181-1187) Klinisk Biokemisk afd. KB3011

Opblanding: CSV, Pleura- og Ascitesvæske Blodvender : 2 – 5 minutter (benyt stopur). (Anbefales ikke af SYSMEX. til CSV – skrevet til senere – MG) ) Med hånden: Forsigtigt men grundigt 10 – 15 gange.   Ledvæske Blodvender : 5 – 10 minutter (benyt stopur). Jo mere viskøs væsken er, jo vigtigere er det at få den godt opblandet. Klinisk Biokemisk afd. KB3011

73 CSV prøver, RBC-konc: 0 – 540000 x 106/l Validering…. Metodesammenligning CSV- RBC tællekammermetoden/ KX 21 vs. XN. 73 CSV prøver, RBC-konc: 0 – 540000 x 106/l Acceptabel gennemsnitlig spredning: 15 % (relativt) for antalskoncentration >3000 x 106/l 500 x 106/l (absolut) for antalskoncentration ≤3000 x 106/l. Klinisk Biokemisk afd. KB3011

Benyttes data fra RBC-BF2 Nedre RBC-detektionsgrænse (Iflg. Sysmex). 0,003 x 106/µl =3000 x 106/l hvilket var uacceptabelt højt for os. Benyttes data fra RBC-BF2 Fås 1 decimal mere. X1000 = 106/l Klinisk Biokemisk afd. KB3011

Nedre detektionsgrænse RBC-BF (egne us.) Analysering af 5 prøver med lav antalskoncentration af erythrocytter (<500 x 106/l) Detektionsgrænsen er fastsat til 0 + 5SD Middel SD: 52,7 x 106/l Nedre detektionsgrænse: 264 x 106/l = 300 x 106/l En detektionsgrænse på 300 x 106/l er en forringelse af den nuværende grænse, men klinisk acceptabel. I tilfælde, hvor en afdeling ønsker større præcision kan prøven tælles i mikroskop, hvis laboratoriet anmodes derom senest en time efter prøvens modtagelse. Klinisk Biokemisk afd. KB3011

Validering…. Metodesammenligning CSV- RBC tællekammermetoden/ KX 21 vs Validering…. Metodesammenligning CSV- RBC tællekammermetoden/ KX 21 vs. XN. 7 prøver er udeladt af sammenligningen, fordi det skønsmæssigt er vurderet at afvigelsen er så stor, at det er sandsynligt at der er sket menneskelig fejl eller anden utilsigtet årsag. Bla. ”gamle / skrøbelige erythrocytter”. Klinisk Biokemisk afd. KB3011

Kommentar noteret på analyseark til mikroskop Udeladte CSV- RBC: Prøve nr. Mikroskop (x 106/l) XN-2000 Kommentar noteret på analyseark til mikroskop 116 1116 19200 Ingen kommentar 121 137 7700 ”Mange gamle ery” 129 140 6600 160 1728 17500 168 304 1300 169 15500 38900 ”Der ses utydelige skygger” 172 2860 7600 Klinisk Biokemisk afd. KB3011

Validering…. Metodesammenligning CSV- RBC tællekammermetoden/ KX21 vs Validering…. Metodesammenligning CSV- RBC tællekammermetoden/ KX21 vs. Sysmex XN. Sæt A RBC: 0 – 540.000 106/l N=66 Sæt B RBC: 0 – 3.000 x106/l N=40 Method Comp.- Deming fit. y =1,03x + 37 y = 1,02x +50 Agreement- Altman Bland test Bias = 642 (95% CI: –37 to 1323) Bias = 58 (95% CI: –0,5 to 116,6) Regerssion- Linear: R2 = 1,00 R2 = 0,93 Klinisk Biokemisk afd. KB3011

Validering…. Metodesammenligning CSV- RBC tællekammermetoden/ KX21 vs Validering…. Metodesammenligning CSV- RBC tællekammermetoden/ KX21 vs. XN.

Validering…. Metodesammenligning CSV- RBC tællekammermetoden/ KX21 vs Validering…. Metodesammenligning CSV- RBC tællekammermetoden/ KX21 vs. XN.

Konklusion CSV-RBC Metoden opfylder de opstillede kvalitetskrav og instrumentet kan tages i brug til rutineproduktion (CSV) snarest. Klinisk Biokemisk afd. KB3011

Hvad med Led-ascites-peritoneal og evt. Bal og pericardievæske ? TC-BF WBC-BF Klinisk Biokemisk afd. KB3011

TC-BF /XN) x106/l (WBC-BF) 114 475 353 (351) Hvad med Led-ascites-peritoneal og evt. Bal og pericardievæske (foreløbige undersøgelser) ? Løbenr WBC rutine x106/l TC-BF /XN) x106/l (WBC-BF) 114 475 353 (351) Asc (0,5 % mesothelceller) 123 42 81 (64) Asc ( ca. 35 % mesothelcel.) 134 117 107 (82) Asc (Ot. dom af meso (22 %)) 152 534 (458) 535 (467) Plv (m 7% meso + 32 % macro)) 156 257 196 (170) Asc ( 12% meso) 576 -699 (638) 592 (521) BAL Klinisk Biokemisk afd. KB3011

Andre BF’s Det ser bestemt lovende ud med andre BF’s (som ofte dukker op i aften/ nattetimerne på KB3011). Vi vil fortsætte med validering af disse væsker også. Akkreditering ?? PT er kun RBC og WBC i CSV akkrediteret. De andre væsker og differentialtælling er ikke. Vi håber ved ibrugtagning af SYSMEX XN at kunne validere samtlige BF-hæmatologi-analyser. . Klinisk Biokemisk afd. KB3011

Hvad med MN % og PMN %. (Cytospin-Præp Hvad med MN % og PMN % ? (Cytospin-Præp. med mange smudge cells er udeladt) Klinisk Biokemisk afd. KB3011

PMN% : PMN % N= 42 R2 : 0,91 Klinisk Biokemisk afd. KB3011

Konklusion MN% og PMN%. Der er ses en rimelig sammenhæng mellem XN-differentialtælling og differentialtælling udført på farvet Cytospinpræparat i CellaVision DM96. Men dette er baseret på få prøver. Klinisk Biokemisk afd. KB3011

Eksempel: CSV-prøve med blaster Sysmex XN-udskrift: Research: NE-BF: 5,6 % LY-BF : 50,8 % MO-BF: 43,6 % Ingen alarmer MN : 95 % PMN: 5 % Klinisk Biokemisk afd. KB3011

Samme prøve med blaster (CellaVision DM96-skærmprint) 15 % Lymf 80 % Blaster 5 % mono/macro Klinisk Biokemisk afd. KB3011

Konklusion differentialtælling Sysmex XN Vi er i tvivl om, hvorvidt man kan ”fange” prøver med umodne leukocytter/ tumorceller/ mesothelceller mv. ud fra alarmsystemet i XN. Så til vores daglige brug vil vi – indtil videre – fortsat benytte Cytospinpræparation og CellaVision DM96. Klinisk Biokemisk afd. KB3011

Referenceområder (kerneholdige celler): Nuværende: Forslag Appr. Guideline ( x 106/l) Csv—Leukocytter; antalk.: 5 x 106/l 0 - 5 Pleuravæske—Leukocytter; antalk.: Ikke angivet 1000 – 4000 (1395 – 3734) CAP: < 1000 (Asc) Peritonealvæske—Leukocytter; antalk.: LABKA: 1 x 106/l ? 0 – 100 CAP : <100 Ledvæske—Leukocytter; antalk.: Ikke angivet 10 – 200 (13 – 180) CAP < 200 Klinisk Biokemisk afd. KB3011

Nye NPU-koder og analysenavne til BF celletælling og differentialtælling ? Vi mener ikke man hverken manuelt (i tællekammer) eller maskinelt kan adskille de kerneholdige celler fra hinanden. (WBC, tumorceller,mesothelceller, erythroblaster, svampe, mikroorganismer, mv). Dette kan først ske ved differentialtælling i mikroskop. Derfor har vi kontaktet LabTerm og fået nyt navn og NPU-kode for CSV og de andre BF mht. tælling af WBC, som vi ønsker skal hedde kerneholdige celler. Eksempel. : Csv-Kerneholdige celler; antalk. Enhed: x 106/l IFCC-IUPAC-kode: NPU028838 Og i øjeblikket er vi ved at søge om nye NPU-koder og navne til differentialtællingen. Klinisk Biokemisk afd. KB3011

Kommentarer / spørgsmål modtages gerne Slut på første del …. Kommentarer / spørgsmål modtages gerne Mail : grome@rh.dk Klinisk Biokemisk afd. KB3011