Laboratoriemodel af trombocytopeni i fuldblod Laboratoriemodel af trombocytopeni i fuldblod. Effekt af in vitro tilsætning af trombocytter og rekombinant faktor VIIa Ole Halfdan Larsen, Jørgen Ingerslev, Niels Clausen, Lisbeth Norengaard, Kirsten Christiansen, Benny Sørensen Center for Hæmofili og Trombose Aarhus Universitets Hospital, Skejby ole.halfdan.larsen@ki.au.dk

Store tanker – få m2 Professoren Fodenden

Baggrund Trombocytopeni Medfødt eller erhvervet Forårsaget af Utilstrækkelig produktion Cytostatika Øget forbrug/destruktion Blødning Immunologisk Trombocytsygdomme

Baggrund Trombocytopeni Trombocytopeni associeret til blødningsrisiko

Baggrund Trombocytopeni Behandling af blødning ved trombocytopeni Infusion af trombocytter I enkelte tilfælde insufficient eller kontraindiceret Risiko for: Infektion Allergiske reaktioner

Baggrund Rekombinant faktor VIIa - NovoSeven® Registrerede indikationer Hæmofili med inhibitorer / erhvervet hæmofili Glanzmanns trombasteni Faktor VII mangel Off-license Enkelte studier har antydet at rFVIIa kan have hæmostatisk potentiale ved trombocytopeni Kristensen J et al, Haemostasis 1996;26 Suppl 1:159-64. Tranholm M et al, Thromb Res 2003 Feb 15;109(4):217-23.

Formål Etablere en laboratoriemodel af trombocytopeni i human fuldblod Visualisere koagulopatien ved trombelastografisk måling af dynamisk fuldblods koagulation Evaluere det hæmostatiske potentiale af friske blodplader eller rFVIIa ved in vitro tilsætning

Hypoteser Trombocyt-tallet kan reduceres til < 60 x 109/L i fuldblod Det reducerede trombocyt-tal vil medføre nedsat maksimal hastighed af fuldblods clot formation In vitro tilsætning af friske trombocytter eller rFVIIa kan revertere den inducerede koagulopati

Materialer og metoder Fremstilling af trombocytopent fuldblod Citrat fuldblod fra 13 raske frivillige

Materialer og metoder Fuldblods koagulations profiler ROTEM Thrombelastographic Coagulation Analyzer Dynamiske koagulations parametre blev beregnet i et software program Analyse procedure: 280 µl citrat fuldblod 20 µl Buffer/Intervention 20 µl tissue factor (Innovin®) – final TF dilution 1:17,000 + CaCl2 200 mM B. Sørensen et al., J Thromb Haemost 2003; 1(3): 551-58

Kontinuerlig fuldblods koagulations analyse Trombelastografi Med thrombelastografi er det muligt at analysere de fysiske ændringer der sker i forbindelse med fuldblods koagulation, og derved opnå information of clot initiering, clot udvikling og clot størrelse. Med andre ord – thrombelastografi visualisere en kontinuerlig koagulations profil som animeret her. Traditionelt har man anvendt 3 paremetre til at beskrive det trombelastografiske signal. CT – clotting timer – er tiden indtil clot formationen starter. CFT – clot formation time – er et udtryk for den initiale dynamik af clot formtionen, mens MCF – maximum clot firmness – udtrykker styrken eller den maksimale elasticitet der er opbygget i coaglet. Bemært nu halvdelen af denne kurve !!

Kontinuerlig fuldblods koagulations analyse Trombelastografi Her er halvdelen af samme trombelastografiske koagulationsprofil. Ved at differentiere – altså beregne hældningen til hver hver målepunkt kan denne clot formations profile transformeres til en dynamisk hastigheds profil af clot formation. Med andre ord – denne kurve illustrerer matematisk set første derivering af det trombelastografiske signal. Vi introducerer hermed nogle nye dynamiske koagulations parametre – MaxVel, t, MaxVel samt AUC. Deskriptivt kan koagulationsforløbet hermed beskrives ved en initieringsfase samt en propagations fase. B. Sørensen et al., J Thromb Haemost 2003; 1(3): 551-58

Materialer og metoder Andre parametre Trombocyt-tal Kontrol screening: PT, APTT, TT, fibrinogen, AT og D-dimer P-selectin Leukocytter og erytrocytter Total p-kalium pH

Resultater Effekt af procedure på trombocyttal

Resultater Effekt af trombocyttal på MaxVel

Resultater Trombocyttal vs MaxVel MaxVel aftager eksponentielt med trombocyt-tallet

Resultater Tilsætning af trombocytter eller rFVIIa Trombocytter  komplet revertering RFVIIa  partiel revertering

Resultater - Kontrol forsøg Parametre før og efter maksimal manipulation APTT [sec] 32.7 34.3 PT [sec] 8.6 8.5 Fibrinogen [g/L] 3.2 3.3 Leukocytter [x109/L] 6.3 5.8 Erytrocytter x1012/L] 4.4 4.2 Total p-kalium [mmol/L] P-selectin [µg/L] 30.0 27.4 pH 7.2 Koagulationsfaktorer Andre blodceller Trombocyt præaktivering pH

Konklusion En brugbar laboratoriemodel af trombocytopeni i fuldblod er blevet etableret Den inducerede koagulopati var primært karakteriseret ved en reduceret MaxVel Tilsætning af friske trombocytter reverterede koagulopatien Tilsætning af rFVIIa (1µg/mL) medførte en signifikant partiel korrektion

Foreløbig anvendelse af model Sammenligning med patientgrupper Trombocytopene børn N=8, aldersgennemsnit 9 år (range 3-15) Trombocyttal gns. 28x109/L (range 7-45) Malign lidelse

Trombocytopene børn (N=8) In vitro tilsætning af rFVIIa og PRP Ingen forøgelse af MaxVel ved tilsætning af rFVIIa 1 eller 4 µg/mL

Trombocytopene børn vs model Vurdering af trombocyt-funktion Aggregations analyse Multiplate® Platelet function analyzer med Horm® kollagen (8 µg/mL) som agonist.

Trombocytopene børn vs model Trombocyt aggregation Samme gennemsnitlige trombocyttal i grupperne Den reducerede effekt af rFVIIa observeret kan skyldes kvalitative ændringer i børnenes trombocytter

Konklusion Ved de undersøgte tilstande af trombocytopeni fandt vi at intervention med raske trombocytter reverterer koagulopatien Ved trombocytopeni med normal trombocytfunktion fandt vi signifikant hæmostatisk effekt af rFVIIa Der findes særlige tilstande af tromboctopeni hvor man må forvente reduceret effekt af rFVIIa

Perspektiver Finde årsager til reduceret trombocyt-funktion hos børn som har fået kemoterapi Antibiotika Effekten af kombination af raske trombocytter og rFVIIa

Tak for opmærksomheden Acknowledgement Vejledere Benny Sørensen Jørgen Ingerslev Niels Clausen Forsknings bioanalytikere: Kirsten Christiansen Lisbeth Norengaard Mange hjælpsomme mennesker på CHT Tak for opmærksomheden