Koagulation – ACL TOP Modul 4 Ved Peter Böhm Nielsen

Disposition Kort introduktion til hæmostase Gennemgang af ACL TOP udstyret Turbidimetrisk måleprincip APTT-analysen Analyse af koagulationsfaktorer 2,7,10

Thrombocytter Thrombocytter kaldes også blodplader. De dannes fra den samme fælles stamcelle som erythrocytter og leucocytter. Thrombocytter har ingen kerne og kan derfor ikke dele sig. De dannes i knoglemarven af en særlig celletype, Megakaryocytter. De store celler afsnører små ”pakker” af cytoplasma omgivet af en del af cellemembranen. Det er disse ”pakker” som kaldes thrombocytter.

Thrombocytter generelt Thrombocytter forlader aldrig blodbanen. Har en levetid på ca. 10 dage, destrueres vha. makrofager i milten eller leveren. Indeholder celleorganeller og cytoplasmiske enzymer som sørger for ATP produktion og syntese af vigtige biologiske produkter som lagres i vesikler.

Thrombocytter funktion Thrombocytter aktiveres ved karskade og binder sig til vævet i det skadede område. Det skadede kar kontraherer Vesiklerne udtømmer deres indhold, actin og myosin får thrombocytten til at trække sig sammen. Thrombocytterne agglutinerer og danner derved en prop. Blødning standses mekanisk, og de hæmostatiske mekanismer (koagulationen) vil nu finde sted. Der dannes et netværk af fine fibrintråde i - og omkring proppen som derved forstærkes. Processen kan vare op til ½ time

Thrombocytters funktion / Hæmostase

Hæmostase Hæmostase er fællesbetegnelsen for de processer i kroppen som permanent kan stoppe en indre eller ydre blødning som følge af skade på en blodåre. Det er en kompliceret proces, der følger en række trin, hvor hvert trin bygger på det foregående Kædereaktionen kaldes koagulationskaskaden

Hæmostase - koagulation Koagulationsprocessen er en kaskade af kemiske processer, der involverer et antal proteiner i blodet (koagulations faktorer), som tilsammen medfører at blodet danner et koagel, som forstærker den prop som thrombocytterne etablerede. Processen afsluttes med fibrinolysen, som er dem proces hvor koaglet igen nedbrydes så blodet atter kan flyde normalt i blodåren

Koagulationen Der indgår koagulationsfaktorerne: Faktor I – XIII (FVI findes ikke). Koagulationsfaktorerne er proteiner som dannes i leveren. De cirkulerer i blodbanen i inaktiv form, først ved en koagulationsproces bliver de aktiveret. Ca2+ ioner, som findes i blodbanen er nødvendig ved koagulationsprocessen. Antikoakulans, der binder Ca2+: Citrat, EDTA og oxalat

Koagulationen

Fibrinolyse Når vævsheling finder sted og der ikke mere er brug for koaglet. Fibrintrådene nedbrydes,således at koaglet går i opløsning. Derved kan blodkar som har været helt stoppet af koagel igen blive åbnet. Fibrinolysen er som koagulations-processen kompliceret

Prøvemateriale koagulation Fuldblod med tilsat antikoagulans (citrat) Plasma er blod tilsat antikoagulans og centrifugeret (plasma øverst) Plasma indeholder koagulationsfaktorer Serum blod uden antikoagulans og centrifugeret (serum øverst) Serum indeholder ikke koagulationsfaktorer http://www.youtube.com/user/academiadeciencia#p/a/u/0/9QVTHDM90io

QUIZ-time

Spørgsmål 1 ? Spørgsmål 2 ? Hvad indgår i den primære hæmostase ? Koagulationsfaktorerne V, VII og X Plasminogen Thrombocytter Spørgsmål 2 ? Hvor kommer thrombocytterne fra ? Milten Megakaryocytter Neurale celler

Spørgsmål 3 ? Spørgsmål 4 ? Hvad kan thrombocytterne blandt andet? Gå ud i vævet og fjerne bakterier Agglutinere Initiere koagulationen selv Spørgsmål 4 ? Hvad gør citrat ved blodet ? Hæmmer faktor VIII Er en del af fibrinolysen Virker antikoagulerende

Spørgsmål 5 ? Spørgsmål 6 ? Hvad initierer koagulationssystemet ? Vævsskade og/el. bristede blodkar Høj koncentration af lipider i blodet Makrofager Spørgsmål 6 ? Hvordan styres koagulationen når den er aktiveret? Via intracellulære signalstoffer Via hæmmere og clotdannelse Via milten

ACL TOP ACL TOPer en fuldautomatisk koagulationsanalysator, der udfører afpipettering af prøver, prøvefortynding, afpipettering af reagens, kalibreringskurve og beregning af prøveresultater, samt transmission af data til computer

ACL TOP apparat-funktioner (1)

ACL TOP apparat-funktioner (2)

ACL TOP apparat-funktioner (3)

Fotometerenhed (ORU – Optical Reading unit) ACL TOP anvender fotometrisk registrering af reaktionen i kuvetten og har en lineær lysvej, der kan anvendes til både absorptionsfotometri og turbidimetri. Der aflæses altid ved de to anvendte bølgelængder: 671 nm (clot og immunologiske tests) og 405 nm (chromogene og immunologiske tests).

Turbidimetri (1) Turbidimetri Lambert-Beers lov: A = log(I1/I0) A =  · d · c

Turbidimetri (2) Fibrindannelse registreres turbidimetrisk målt som absorbans ved 671 nm. Måleopløsningens turbiditet stiger efterhånden som Fibrin dannes. Koagulationstiden defineres som det punkt, hvor der indtræder en pludselig stigning i absorbansen.

ACL TOP apparat-funktioner (4) Racks

Reagensplacering (1)

Reagensplacering (2) Diluent Reagenser

Prøve placering

Spørgsmål 1 ? Spørgsmål 2 ? Må prøverne have prop på i ACL TOP ? Ja Nej Spørgsmål 2 ? Hvordan måles turbidimetri ? Sensitiv fokusering Fotometrisk Nephelometrisk

Statistisk baggrund (1) Middelværdi: Spredning: Variations-koefficient:

Statistisk baggrund (2)

Kontrolregler Westgard Falder en kontrol uden for middelværdien ± 2 SD vurderes ved brug af nedenstående tabel 1 Westgard-kontrolregler om kontrolresultatet fører til forkastelse eller godkendelse (evt. med advarsel) af analyseresultaterne

Acceptgrænser i ACL TOP (1)

Acceptgrænser i ACL TOP (2)

Kontrolkort (1) Præcisions kontrol

Kontrolkort (2) Præcisions kontrol

Extern kontrol Nycotest PT, arb,Enh/L (1)

Extern kontrol Nycotest PT, arb,Enh/L (2)

Extern kontrol Nycotest PT, INR

Kalibreringskurve (1) Forklar princippet ?

Kalibreringskurve (2)

Kalibreringskurve (3) Reaktionskurve for 100%

Sensitivitet og specificitet Analytisk Hvad menes med en analyses ”Specificitet”? - Evne til at måle netop den kvantitet Hvad menes med en analyses ”Sensitivitet”? - Analysens følsomhed (hældning på kurve)

Sensitivitet, specificitet & cutoff Diagnostisk

Reference interval Raske individers 95% normal-interval

Resultatvurdering (1) Y – Akse: Repræsenterer ændring i absorbans under reaktionen. X – Akse: Ændring i tid under reaktionen.

Resultatvurdering (2) Baseline: Reagens og prøve mixes. Er generelt kort for normale prøver og længere for abnormale prøver. Acceleration: Her dannes fibrin clot. En stejl hældning vises ved normale prøver, hvor en svagere hældning fremkommer ved abnormale prøver. Deceleration: Al fibrinogen er konverteret til fibrin, så reaktionen når plateu-fasen. Svage clots kan få negativ hældning i plateu-fasen. Delta: Ændring i absorbans mellem baseline og endpoint fase.

Aktiveret Partiel Thromoplastin tid - APTT (1) Screeningsanalyse, der giver et mål for aktørerne i den interne koagulationskaskade. Testes ved APTT analyse

Aktiveret Partiel Thromoplastin tid - APTT (2) Initiering: Plasma inkuberes med Hemosil APTT-SP opløsning, der indeholder phospholipid og silica opløsning. Aktivering: Calcium tilsættes og reaktionen løber til ende. Detektering: Koagulationstiden fra tilsætning af calcium til fibrin-dannelse måles med turbiditetsmåling ved 671 nm.

Aktiveret Partiel Thromoplastin tid - APTT (3) P-APTT er forlænget ved: Nedsat funktion af en eller flere specifikke koagulationsfaktorer til under 30% af middelværdien Heparinbehandling Lupus antikoagulans

Aktiveret Partiel Thromoplastin tid - APTT (4) Kalibrering: ikke relevant – den direkte clot-tid er resultatet Kontroller: 2 stk: normal og abnormal Måleområde: 20-240 sek. Standard måleområde: 20-90 sek. Referenceinterval: 0-30 dg: 28-50 sek. >1 md: 23-35 sek. Terapeutisk interval: 55-100 sek.

Aktiveret Partiel Thromoplastin tid - APTT (5) Resultater Normal reaktion med afledede kurver vist.

Aktiveret Partiel Thromoplastin tid - APTT (6) Resultater Forlænget reaktion med afledede kurver vist. Svagere hældning på kurven.

Aktiveret Partiel Thromoplastin tid - APTT (7) Resultater Lille reaktionsinterval – 2. afledet kurve ikke acceptabel i forhold til valgte grænser.

Aktiveret Partiel Thromoplastin tid - APTT (8) Resultater Forlænget reaktionstid – ud over måleområde Svar: >240 sek.

Koag.faktorerne II+VII+X (Funk.&INR) (1) En screeninganalyse, der giver et samlet mål for den katalytiske aktivitet af koagulationsfaktorerne: II, VII & X. Faktor VII er ansvarlig for aktivering af koagulations-kaskaden via den ”eksterne vej”. Syntesen af alle 3 faktorer er afhængig af K-vitamin og de produceres alle i leveren.

Koag.faktorerne II+VII+X (Funk.&INR) (2) Aktivering: Fortyndet citrat plasma inkuberes med Nycotest PT, der indeholder thromboplastin, phospholipid og calcium. Reaktionsbetingelserne er optimeret, da Nycotest PT indeholder FV og fibrinogen, så det kun er Faktorerne II, VII & X, der er bestemmende for prøvens koagulationstid. Detektering: Koagulationstiden måles ved fibrin-dannelse med turbiditetsmåling ved 671 nm. Sammenhængen mellem arbitrærstofkoncentration og koagulationstid fastlægges via kalibreringskurve.

Koag.faktorerne II+VII+X (Funk.&INR) (3) P-KF II+VII+X er forlænget ved: Leverinsufficiens Malabsorption og K-vitaminmangel (nedsat syntese) Flere thrombotiske processer (øget forbrug) Behandling med K-vitamin antagonister (blodfortyndende medicin)

Koag.faktorerne II+VII+X (Funk.&INR) (4) INR Analyseniveauet er meget afhængig af thromboplastin-reagenset, hvorfor WHO har indført internationale thromboplastiner: International Normalized Ratio (INR). INR = (T Patient / T normal)ISI, hvor ISI er karakteristisk for det enkelte thromboplastin. Eks: INR = 44 sek. / 22 sek. = 2

Koag.faktorerne II+VII+X (Funk.&INR) (5) Kalibrering: DEKS normal og INR (høj & terapeutisk) Kontroller: 2 stk: normal og abnormal Måleområde: Koagulation: 0,05-1,5 arb.stofk. INR: 8,0-0,9 Referenceinterval: Koagulation: 0-1 md: >40 arb.enh./l >1 md: >60 arb.enh./l

Koag.faktorerne II+VII+X (Funk.&INR) (6) Referenceinterval: INR: 0-1 md: 1,6 >1 md: 1,3 Terapeutisk interval: 2,0-3,0 (undtaget er dog tilstande, hvor specifikke mekaniske hjerteklapper er indopereret)

Koag.faktorerne II+VII+X (Funk.&INR) (7) Resultater Normal reaktion med afledet kurve vist.

Koag.faktorerne II+VII+X (Funk.&INR) (8) Resultater Forlænget reaktion med afledet kurve vist.

Koag.faktorerne II+VII+X (Funk.&INR) (9) Resultater Lipæmisk prøve – mABS høj Ultracentrifugering mulig.

Koag.faktorerne II+VII+X (Funk.&INR) (10) Resultater Lille reaktionsinterval – 1. afledet kurve ikke acceptabel i forhold til valgte grænser.

Koag.faktorerne II+VII+X (Funk.&INR) (11) Resultater Meget forlænget reaktionstid – måske stigning efter 135 sek.