Cold-PCR & Droplet Digital PCR

”Fortynding” af cancer med normale celler Cancercelle ”fortyndet” i normale celler

Cold-PCR vs konventionel PCR

Lightscanner & heteroduplex princip Heteroduplexer Homoduplexer A T A C G T A T G C G C

Fortyndinger og LightScanner resultater Ved forbrug af 50ng DNA/reaktion vil forholdet mellem WT kopier og variant DNA kopier være følgende:   1:1 - 50% - 8325/8325 kopier 1:10 - 10% - 14985/1665 kopier 1:20 - 5% - 15818/833 kopier 1:40 - 2,5% - 16234/416 kopier 1:80 - 1,25% - 16442/208 kopier 1:160 - 0,625% - 16546/104 kopier 1:320 - 0,3125% - 16598/52 kopier

Sekventering af fortyndinger Konventionel vs Cold-PCR Cold-PCR – diverse fortyndinger 10% 5% 2,5% 1,25% 0,625% Konventionel PCR – heterozygot 1:1 Konventionel PCR – fortynding 1:20

Reference-artikel Coren A. Milbury et al. Clin.Chem.

Droplet Digital PCR Introduktion

Taqman-prober til detektion (1) FRET Match Mismatch

Taqman-prober til detektion (2) SNP: A  T VIC A T FRET FAM

Taqman kromatogram (3)

Droplet Digital PCR – 3rd Generation af PCR Kvantificering 1st 2nd 3rd Real-time PCR Relativ Kvantificering Droplet Digital PCR Absolut Kvantificering

Droplet Digital PCR Workflow Mix reagenser og prøver i 20,000 droplets Udfør PCR på termocycler Kvantificer target DNA/RNA ved at tælle prøve-droplets via fluorescence-signal Digital aflæsning giver absolut måling af target DNA Lav Droplets PCR Droplets Aflæs Droplets

Produktion af Droplets Placer engangs cartridge med prøver og droplet-olie i QX100 Droplet Generator 20,000 droplets per prøve, 2 ½ min for 8 prøver Ensartede droplets 14

Droplets på PCR maskine Forskellige experimenter på samme plade Er ikke låst fast i specifikke PCR protokoller, men kan tilpasses det ønskede target Overfør emulsion til 96-brønds PCR plade

Aflæsning af Droplets Load 96-pladen i QX100 Droplet Readeren Autosampler håndterer den enkelte prøve uafhængigt Droplets ledes forbi optisk detector, der detekterer flourescenssignal fra hver droplet (32 brønde / time) 16

Precision fra 10% fortyndinger 1.1-fold fortyndingsrække af S. aureus Konstant humant gDNA

Copy Number Variation ddPCR individual wells ddPCR merged wells DNA fra 7 cellelinier med kendt copy number variation Resultaterne er normaliseret overfor en kopi af RNase P ddPCR individual wells ddPCR merged wells 18

BRAF V600E fortynding af DNA