Efteruddannelse i Bioteknologi Kursus A
Kursus indhold
Oprensning af PCR-fragment Reaktionsblanding: PCR-produkt Primere Template Enzym MgCl2 Nukleotider
Metode Gelfiltrering Glasfilterbinding Ethanolfældning PCR-produkt i gennemløb Små molekyler tilbageholdes Glasfilterbinding Kun til store PCR fragmenter PCR –produkt tilbageholdes Små molekyler løber igennem Ethanolfældning Umoderne!
Proofreading polymerase Taq-DNA-polymerase indsætter et ekstra A i 3’-enden Taq-DNA-polymerase mangler 3’-5’ proofreading Proofreading DNA polymerase fjerner 3’-A (Klenow-fragment af DNA-PolI, Pfu mv.) RESULTAT: PCR-fragment med blunt-ender
Restriktions enzym BglII (Bacillus globigii) Sticky ends - 5’ overhang
Restriktions enzym Sma I Serratia marcescens Blunt ends
Plasmider
Plasmider
Konjugering
Kromosom transfer
Selektions- markør fx AmpR Plasmid konstruktion Selektions- markør fx AmpR MCS Promotor fx LacZ Selektions- gen fx LacZ’ Origin of replication
pBR322
pUC18
Lac operon
b-Galactosidase b-D-Galactosid D-Galactose IPTG X-Gal
Blue-white selection
Blue-white selection
Arabinose operon
GFP
Plasmidet pJet1.2 Blunt-ended 2,974 bp
Konstruktet
Ligering T4 DNA-ligase MgCl2 ATP
Mulige resultater
Transformation af E.coli
Kompetente E. coli celler Friske voksende celler! Behandles iskoldt med: CaCl2 MgCl2 MgSO4 RbCl DMSO PEG Vask Koncentration Behandles forsigtigt og på is!
Transformation Kompetente celler inkuberes på is 5 – 10 min Varmechock 42°C (50 sec.) Varm medie – med glucose Spredes på en varm agarplade med selections-antibioticum Succesrate: 105- 106 kolonier/µg plasmid
Electroporation Elektrokompetente celler Glycerol Lav ionstyrke Ladning skal bæres af DNA!
Electroporation
Electroporation
Gennemgang af forsøgsvejledning Se i mappen