Formål - at forstå det eksperimentelle grundlag for moderne molekylærbiologisk/genteknologisk arbejde -at kunne bruge dette grundlag til at tolke virkelige molekylærbiologiske data taget fra den videnskabelige litteratur - at kunne bruge dette grundlag til at designe molekylærbiologiske experimenter til belysning af biologiske problemstillinger - at give en dybgående behandling af den makromolekylære syntese og dennes regulering

Eksamensrelevansen af dette er: At dette ikke er et fag man består ved at kunne lærebogen uden af (tværtimod) Derimod består man ved at forstå, læs og forstå derfor de originale eksperimenter som lærebogen er rig på i de enkelte afsnit. Forstå hvad de viser og hvorledes samme teknik generelt kan bruges Sørg for at i forstår problemstillingerne og løsningerne på de opgaver vi gennemgår hver onsdag eftermiddag Erfaringsmæssigt oplever de studerende problemorienterede opgaver som svære Fortvivl ikke hvis opgaverne virker svære når i forbereder jer hjemme. Det vigtige er, at forstår dem efter regnetimerne

(restriktions endonukleaser) Restriktions enzymer (restriktions endonukleaser)

Restriktions enzymer genkender og binder en bestemt nukleotid-sekvens og spalter DNAet. Kan deles op i tre typer. Type I binder til en bestemt DNA sekvens, men skærer et tilfældigt sted derfra. Type II binder og skærer samme sekvens. Type III binder og skærer også samme sekvens. Type II enzymer vi bruger i laboratoriet.

Restriktionsenzymer navngives efter den bakterie hvorfra de oprindelig er isoleret Sædvanligvis har de et navn på tre bogstaver, det første fra genus og de næste to fra species navnet. Nogle gange har enzymer et fjerde bogstav som refererer til den specifikke stamme enzymet oprindeligt er fundet i. De første tre bogstaver af enzymnavnene skrives altid med stort. F.eks. SmaI, Serratia marcescens EcoRI, Escherichia coli PstI, Providencia stuartii

Type II enzymer genkender og spalter som regel en 4, 6 eller 8 nukleotider lang sekvens af dobbeltstrenget DNA. Nogle skærer DNAet lige over (blunt end skæring). F.eks. SmaI, 5’ CCCGGG 3’ 3’ GGGCCC 5’ . 5’ CCCOH 3’ 5’ pGGG 3’ 3’ GGGp 5’ 3’OHCCC 5’

Nogle skærer DNAet så det giver 5’ overhang EcoRI: 5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’ 5’ GOH3’ 5’ pAATTC 3’ 3’ CTTAAp 5’ 3’OHG 5’

Nogle skærer med 3’ overhang Pst I: 5’ CTGCAG 3’ 3’ GACGTC 5’ 5’ CTGCAOH 3’ 5’p G 3’ 3’ Gp 5’ 3’ OHACGTC 5’

http://www. neb. com/nebecomm/products/category1 http://www.neb.com/nebecomm/products/category1.asp New England Biolabs, den største leverendør af restriktionsenzymer

Hvor skærer restriktionsenzymerne i et givet stykke DNA ? Der findes diverse freeware på nettet bl.a. webcutter2 http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/

atgtct aaaggtgaag aattattcac tggtgttgtc ccaattttgg ttgaattaga 121 tggtgatgtt aatggtcaca aattttctgt ctccggtgaa ggtgaaggtg atgctactta 181 cggtaaattg accttaaaat ttatttgtac tactggtaaa ttgccagttc catggccaac 241 cttagtcact actttcggtt atggtgttca atgttttgct agatacccag atcatatgaa 301 acaacatgac tttttcaagt ctgccatgcc agaaggttat gttcaagaaa gaactatttt 361 tttcaaagat gacggtaact acaagaccag agctgaagtc aagtttgaag gtgatacctt 421 agttaataga atcgaattaa aaggtattga ttttaaagaa gatggtaaca ttttaggtca 481 caaattggaa tacaactata actctcacaa tgtttacatc atggctgaca aacaaaagaa 541 tggtatcaaa gttaacttca aaattagaca caacattgaa gatggttctg ttcaattagc 601 tgaccattat caacaaaata ctccaattgg tgatggtcca gtcttgttac cagacaacca 661 ttacttatcc actcaatctg ccttatccaa agatccaaac gaaaagagag accacatggt 721 cttgttagaa tttgttactg ctgctggtat tacccatggt atggatgaat tgtacaaata 781 a

Restriktionsenzymer forekommer sammen med et modifikationssystem for at undgå fordøjelse af bakteriens eget DNA Modifikationsenzymerne er methylaser, som methylerer nukleotider i restriktionssitet Modifikation af den ene DNA streng nok til at forhindre nedbrydning (ellers ville bakterien få problemer under DNA replikationen) Dette har den praktiske betydning, at man skal vælge en E. coli stamme, der er restriktions-negativ, når man ønsker at introducere DNA fra en anden organisme eller anden E. coli stamme for at undgå fordøjelse af DNAet. Type I og III’s nuklease aktivitet sidder i samme protein som methyleringsaktiviteten For Type II enzymer er aktiviteterne adskilt i forskellige proteiner

For at DNA stabilt kan opretholdes i en voksende bakterie-population er det essentielt at - det kan replikeres at det fordeles effektivt mellem moder og dattercelle stabil opretholdelse af DNA fragmenter fra en anden organisme må derfor sikres ved at DNA fragmentet ”sættes sammen med” DNA som har de to ovennævnte egenskaber dette DNA benævnes en ”vektor” og er typisk enten et plasmid eller en virus/bakteriofag plasmider er naturligt forekommende, autonomt replikerende cirkulære stykker DNA som bibringer bakterien en selektiv fordel i forskellige miljøer (f.eks. antibiotika resistens) in vitro fremstillede varianter af naturligt forekommende plasmider og bakteriofager.

Hvordan får vi DNAet ind i E. coli igen ? Det ligerede DNA introduceres i en E. coli stamme ved transformation (hvis et plasmid) eller ved transduktion (hvis en bakteriofag) For at E. coli kan optage DNA skal cellerne gøres kompetente ved behandling med CaCl2 eller ved at cellerne udsættes for et kraftigt elektrisk felt i tilstedeværelse af DNA (elektroporation)

Hvordan får man fat på en bestemt genomisk eller cDNA klon ? Med en klon vil vi forstå en bakterie der indeholder en vektor med et bestemt stykke genomisk/cDNA Fremstilling af genom og cDNA biblioteker Screening af genom- og cDNA biblioteker Ekspressionskloning Komplementation i mikroorganismer Subtraktionskloning Microarray Differential display

Konceptet er at få indsat genomsekvenser eller cDNA sekvenser i en vektor på den mest effektive måde, så alle sekvenser i genomet/alt mRNA er repræsenteret i biblioteket. Biblioteker fremstilles næsten altid i E. coli En vigtig faktor er her introduktion af DNAet i E. coli. (plasmider transformeres, bakteriofager transduceres)

Hvor stort skal et bibliotek være for at alle sekvenser er med ? N = ln(1-P)/ln(1- 1/n) N = antal kloner i biblioteket P = sandsynligheden for at en given sekvens er med i biblioteket n = genomets størrelse divideret med den gennemsnitlige fragmentlængde i biblioteket data er fra fremstiling af et genombibliotek fra mus N = ln(1-0.95) ln(1- 1/2.6 106kb/20 kb) N = 4.2 105

Når man skal fremstille et repræsentatitvt bibliotek er det vigtigt at alle parametre er optimerede En af de vigtige parametre er introduktion af det rekombinante DNA ind i E. coli. Her kan man benytte sig af at bakteriofager fra naturens side er selekteret til at inficere deres værtsorganisme yderst effektivt Rekombinante bakteriofager har således en evne til at introducere DNA, med en mellem 10 og 100 gange højere effektivitet end transformation med plasmid DNA

EM billede af lambda Hoved hvori DNA er pakket Halen Halefibre

Strukturen af vild type lambda Lineært dobbeltstrenget DNA med 12 nukleotiders overhang i 5’ enderne (COS sites[cohesive ends])

Lambda livscyklus lysogen cyklus lytisk cyklus

Livscyklus af lambda

lambda plaques på et tæppe af E. coli der opstår lyse områder der, hvor lambda fagen har lyseret (sprængt) værtscellen

Krav til størrelsen af lambda for at den kan pakkes i faghoveder. fra 75% til 105% af vildtypens størrelse

Spi = sensitive to P2 inhibition En vild type lambda kan ikke gro på en E. coli stamme der er lysogen for bakteriofagen P2 En lambda der mangler rekombinationsgenerne red, gam kan derimod godt gro på en P2 lysogen stamme Erstattes red gam regionen med ”fremmed” DNA kan den rekombinante fag gro på en P2 lysogen stamme Spi fænotypen Spi = sensitive to P2 inhibition red, gam

To typer lambda vektorer Replacement vektorer Insertion vektorer

Vigtigt at der findes unikke restriktionssites i lambda til at klone genomisk eller cDNA . Vigtigt at rekombinante fager nemt kan skilles fra ikke rekombinante, da det ellers er svært at se, hvor stor biblioteket reelt er Nemt at flytte DNA fra lambda fagen til et plasmid Mulighed for in vitro transkription

Replacement vektoren l-EMBL3

Replacement vektoren l-DASH Op til 25 kb ”fremmed” DNA

Strukturelt kort over insertionsvektoren l ZAPII op til 10 kb cDNA

Insertions vektoren l ZAP express

Strukturen omkring MCS i l-ZAP express Tillader ekspression af klonet cDNA i mammale celler og i E. coli. Blå/hvid screening på X-GAL plader

Strukturels kort over insertionsvektoren l ZAP-CMV

Plaques af lamda med b-galactosidase aktivitet Stoffet X-GAL (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galctopyronoside) laver en blå udfældning når det spaltes af b-galactosidase. Plaques eller kolonier med b-galaktosidase aktivitet er således blå, medens plaques uden aktivitet er hvide

Strukturelt kort over Cosmidet SuperCos Ori, E.coli replikations origin NeoR, resistens gen mod neomycin (G418) SV40 ori, origin fra SV40 virus Cos, cos sites til pakning i l hoveder T3/7, T3/7 promotorer til in vitro transkription op til 50 kb fremmed DNA

Strukturelt kort over et BAC plasmid CmR, gen der giver resistens mod kloramfe-nikol OriS, replikations-origin fra F plasmidet repE, replikations- initiering ParA/B partitioning gener der sikrer effektiv plasmid segregering op til 300 kb

Strukturelt kort over YAC vektoren pYAC4 CEN4, centromer SUP4, tRNA der supppreserer ade2 mutation i gær. Inaktivering af SUP4 gør gæren rød. TEL, telomerer fra Tetrahymena. Skæres med BamHI og EcoRI og ligeres til EcoRI skåret genomisk DNA op til 1 million kb Reeves et al (1992) Methods. Enzymol. 216, 584-603

Hvordan får vi fremskaffet definerede overlappende genomiske DNA fragmenter ? Vi vil gerne have sekvensen af sammenhængende stykke genomisk DNA Løsningen er at skære DNAet partielt (ufuldstændigt) med et enzym der skærer ofte, typisk Sau3A (5’ GATC 3’) Sau3A genererer ender der kan ligeres til BamHI skåret vektor DNA

Sau3A genkendelsessites Hvis vi skærer DNAet med lidt Sau3A i så kort tid, at vi får genereret fragmenter mellem 14-20 kb vil vi få en række forskellige overlappende fragmenter ud af det. Kan vi bestemme sekvensen af de overlappende fragmenter, kan vi sammenstykke sekvensen af hele området.

cDNA syntese mRNA oprenses på en affinitetssøjle med polydT eller polyU Kræver enzymet revers transkriptase der fremstiller en DNA kopi af mRNA Revers transkriptasen kræver en ”primer” (et 15 – 25 nukleotider langt stykke DNA eller RNA) for at kunne starte cDNA syntesen Kræver dNTP (de-oxy-nukleotid trifosfater) og de rigtige fysisk-kemiske forhold Nogle revers transkriptaser har aktivitet ved 55-60oC, hvilket er en fordel, hvis mRNA har meget sekundær struktur Som primere kan anvendes polydT som annealer til polyA halen på mRNA eller random hexamerer (en blanding af alle 26 mulige hexamerer) eller en mRNA specifik primer.

Indkorporering af syntetisk DNA i enderne af cDNAet Mulighed for kloning i bestemt orientering Methyleret dCTP forhindrer skæring i insertet

Homopolymer tailing af cDNA

Screening af biblioteket kræver noget information om det gen man ønsker at klone (eller information om en del af det protein man ønsker at klone genet for)

Screening med en probe Screening med et antistof

Hvordan får man fat i proben ? Nogle har klonet et lignende gen Nogle har klonet det samme gen fra en anden specie Nogle har oprenset proteinet og bestemt noget af den primære struktur.

Table of Standard Genetic Code Den genetiske kode

Plaque lift eller eventuelt koloni lift

Proben kan være: DNA mærket med radioaktivitet eller luminiscerende nukleotider (udsender lys) Radioaktiv eller luminiscerende antistof hvis et ekspressionsbibliotek

Polymerase chain reaction (PCR) måde at amplificere DNA på Kræver: to specifikke primere (syntetisk DNA, typisk mellem 18 og 25 nukleotider lange) en termostabil DNA polymerase dNTP, Mg2+ og buffer

Kloning af manglende 5’ eller 3’ sekvenser af cDNA EST (expressed sequence tags) små stumper cDNA sekvens fra sekventering af cDNA biblioteker

Inverse PCR Kan bruges hvis man gerne vil klone DNA fragmenter der flankerer et stykke DNA med kendt sekvens

Site-directed mutagenese

Fusion af to PCR fragmenter med PCR

Sanger sekventering DNA sekventeringen begynder med at hybridisere en sekvens specifik primer til DNA templaten. Ved hjælp af en termoresistent DNA polymerase forlænges primeren. Da reaktions-blandingen indeholder di-deoxy-nukleotider terminerer reaktionen specifikke steder.

Resultatet af en sekvens reaktion udført med radioaktivt mærkede nukleotider (35S-dCTP) Gammeldags metode

Detektion af sekvens- reaktionsprodukterne som fluorescense

http://www.mwg-biotech.com/html/all/index.php

Ekspressionskloning 1 hybrid analyse (cDNA der koder for DNA-bindende protein og hvor bindingssitet er kendt) 2 hybrid analyse (cDNA der koder for et protein der kan binde til et andet protein) screening af ekspressionsbibliotek (cDNA der koder for en bestemt enzymatisk aktivitet)

En hybrid teknikken GAL4TA: transkriptions aktiverende domærne udføres i gær GAL4TA: transkriptions aktiverende domærne af en gær transkriptions faktor. cDNAet koder for et protein der genkender en bestemt sekvens i DNAet. GAL4TA domæne rekrutterer det generelle transkriptions-apparat og reportergenet transkriberes

2-hybrid analyse GAL4DNA binder til en bestemt DNA sekvens men kan ikke aktivere transkriptionen. Kun hvis X og Y kan binde til hinanden vil GAL4TA kunne rekruttere transkriptionsap-paratet og reportergenet transkriberes.

Ekspressionskloning i xenopus oocytter

Den afrikanske klofrø Xenopus laevis

Ovarier fra Xenopus laevis

Udtagning af æg fra oocyttens ovarier

Måling af strøm gennem oocyttens membran

Assay for funktionel ekspression i Xenopus oocytter

Screening af cDNA bibliotek ved funktionel ekspression i Xenopus oocytter

Fremstil cDNA bibliotek

Kloning af differentielt udtrykte gener (cDNA) Formålet er at klone cDNA, der representerer differentielt udtrykte gener (f.eks. En cancer celle i forhold til en normal celle) Er hele genomet sekventeret og der findes microarray kan differentielt udtrykte gener identificeres ved microarray forsøg. Er helet genomet ikke kendt/der ikke findes microarray kan benyttes differential display eller subtraktiv kloning

Differential display Konceptet er at visualisere alle mRNA molekylær i en celle under to forskellige fysiologiske omstændigheder for at identificere hvilke mRNA molekyler, der er differentielt udtrykt Og få fat i stykke cDNA for hvert differentielt udtrykt gen. cDNA stumpen bruges efterfølgende til at klone fuldlængde cDNA.

Generering af tilfældige cDNA fragmenter mRNA kan deles op i fire grupper efter hvilket nukleotid, der sidder før det første A i polyA halen A 5’ AAAAAAA 3’ G 5’ AAAAAAA 3’ C 5’ AAAAAAA 3’ T 5’ AAAAAAA 3’ Revers transkription med polydTC, polydTG eller polydTA primer vil generere cDNA fra ca. 1/3 af cellens mRNA (Hvis der er et eller flere A’er før polyA halen kommer der på et tidspunkt et G, C eller T)

cDNA 3’ OH CTTTTTTTTT 5’ p 5’ p GAAAAAAAA 3’ OH mRNA Tilsæt en blanding af 40 tilfældige 13 nukleotider lange primere ( ) og polydTC primeren ( ) 3’ OH CTTTTTTTTT 5’ p PCR a-[32P]-GTP

For at visualisere alle de genererede cDNA fragmenter separeres de i en denaturerende poly-akrylamid-gel (indeholder urinstof) De separerede bånd visualiseres ved PhosphoImage analyse Kontrol Prøve Differentielt udtrykt mRNA

cDNA, der repræsenterer differentielt udtrykt mRNA, kan ekstraheres fra gelen og PCR amplificeres med polydTC primeren og de 40 tilfældige 13 merer. Dernæst sekventeres PCR fragmentet Sekvensen kan bruges til at screene et cDNA bibliotek eller til at designe primere til 5’ og 3’ RACE.

Subtraktiv kloning (at finde mRNA der er differentielt udtrykt) Vi fremstiller et cDNA bibliotek fra det væv, vi er interesseret i (kunne være cancervæv) Vi skal så have skaffet prober til at identificere, hvilke mRNA’er, der findes i cancervæv men ikke i rask væv Her kan vi benytte os af, at mRNAet i cancervævet kan opddeles i to klasser. De, som er specifikke for cancervæv og de, som findes i begge typer væv.

1. strengs syntese med radioaktive nukleotider på RNA fra det væv, hvorfra vi vil finde specifikt udtrykt mRNA mRNA fra kontrolvævet. Nogle findes i begge typer væv nogle eventuelt kun i kontrolvævet

Hybridiserer vi nu vores radioaktivt mærkede 1 Hybridiserer vi nu vores radioaktivt mærkede 1. strengs syntese til overskud af mRNA fra kontrolcellerne, vil noget af det enkeltstrengede cDNA hybridisere til mRNA andet vil forblive enkeltstrenget Bruger vi nu denne blanding til at screene vores cDNA bibliotek, vil det kun være det enkeltstrengede radioaktivt mærkede cDNA der kan hybridisere til de plaques, der udgør vores cDNA bibliotek. På denne måde får vi kun identificeret plaques, der indeholder cDNA repræsenterende mRNA, der er udtrykt i vores celler i forhold til kontrolcellerne Vi vil så isolere de interessante plaques og bestemme DNA sekvensen af det indsatte DNA.

Kvantifikation af mRNA mængden northern blot (analog til Southern blot, blot anvendes RNA). Til bestemmelse af få transkripter. RNase protection. Til bestemmelse af få transkripter. real time PCR (quantitative PCR, qPCR). Til bestemmelse af få transkripter. microarray (gene chips) (for bestemmelse af transcriptomet) SAGE (serial analysis of gene expression) (for bestemmelse af transcriptomet)

http://biocompare.com/pcr/tutorial/qpcr/flash_go.html

MX4000 fra Stratagene

Fluorescens detektion i real time PCR maskinen

Southern blotting måde at analysere bestemte DNA fragmenter i en blanding af DNA

RNase protection

Western blotting en måde at visualisere og kvantificere mængden af et enkelt protein i en proteinblanding

Immunoprecipitation en teknik til at kvantificere mængden af et enkelt protein i en protein- blanding. Et eksem- pel på et pull-down forsøg

Pulse-chase forsøg til undersøgelse af makromolekylers halveringstid, syntese hastighed og modifikationer - konceptet er at mærke en population af molekyler i ganske kort tid (pulsen )med radioaktivitet og dernæst tilsættekæmpe overskud af kolde molekyler (chasen)

Electroforetic mobility shift assay (EMSA) til undersøgelse af om en enkelt rent protein kan binde et bestemt stykke DNA/RNA om der i et kerneekstrakt findes et/flere proteiner der kan binde en bestemt DNA/RNA sekvens