BAL-væske Ronni R. Plovsing, MD / PhD student Intensive Care Unit 4131 Department of Anaesthesiology University Hospital Rigshospitalet

Bronkoskopi og Bronkoalveolær lavage Ronster LabTM Bronkoskopi (gr. bronchos ”luftrør”) er en kikkertundersøgelse af luftrør og bronkier Bronkoalveolær lavage (BAL) er en fraktioneret skylning med isotonisk saltvand i det alveolære lungesegment Bronkial irrigation ved brug af en saltvandsopløsning blev første gang beskrevet i 1927 (stift bronkoskop) BAL blev introduceret som et redskab til undersøgelse af den humane lunge i 1974 (fleksibelt bronkoskop)

Bronkoskopi og BAL Ronster LabTM Bronkoskopi udføres oftest med et fleksibelt videobronkoskop i ambulant lungemedicinsk regi Brug af BAL Supplerende diagnostik ved interstitielle lungelidelser Udredning af pneumoni Andre patoanatomiske undersøgelser

BAL hos den vågne forsøgsperson Ronster LabTM

BAL procedure I Ronster LabTM BAL udføres ved at indkile bronko-skopet i et ønsket bronkopulmonært segment (oftest mellemlap eller lingula) Total instilleret volumen af isoton saltvand skal være minimum 100 ml og må ikke overstige 300 ml Saltvand administreres ved 3-5 på hinanden følgende boli efterfulgt af aspiration efter hver instillation Clementsen PF: Bronkoskopi. Respiratory Review 2008; p18-23 Rekommandation (ERS / ATS, 2012): Total instilleret volumen 200-240 ml, 4 separate instilleringer, negativt sug på < 100 mm Hg

BAL procedure II – cellulær analyse Ronster LabTM Total aspireret volumen (retur) skal være ≥ 30 % af total instilleret volumen for at kunne betegnes som en optimal (”ægte”) alveolær prøve Pooling af BAL-væske er i dette henseende acceptabelt mhp. rutine-undersøgelse af cellulære komponenter Cellulær analyse skal udføres på minimum 5 ml (optimalt volumen = 10-20 ml) af den poolede BAL-væske Clementsen PF: Bronkoskopi. Respiratory Review 2008; p18-23 Returvolumen < 30 % kan medføre en misvisende total celletælling og/eller differentialtælling, især når volumen andrager mindre end 10 %. Omvendt vil udtalt fortynding ikke have betydning for resultatet af differentialtælling

Transport og opbevaring – cellulær analyse Ronster LabTM BAL prøven bør transporteres/opbevares i containers eller glas, der er designet til suspension af væv (celler) Ved maksimalt 30-60 min. fra prøvetagning til viderebehandling kan prøven transporteres ved stuetemperatur (bør dog transporteres ved 4°C ved mindste forsinkelse indenfor den første time) 3. Transporttid > 1 time i den originale skyllevæske kan ikke anbefales. Et vævsmedium kan tilsættes, men prøven skal behandles indenfor 2-3 timer for bedste resultat 4. Ved længere behandlingstid centrifugeres prøven (250-300 g i 10 min.) og cellerne resuspenderes i et vævsmedium. Prøven opbevares ved 4°C og skal analyseres indenfor 24 timer.

Analyse af cellulære komponenter Ronster LabTM Total tælling af kerneholdige celler skal foretages manuelt (hæmocytometer). Automatiseret tælling kan ikke anbefales (ukorrekt enumeration af epitelceller og andre non-hæmatopoetiske celler) Differentialtælling skal foretages ved cytocentrifugering, efterfølgende farvning (Wright-Giemsa eller May-Grunwald-Giemsa), og enumeration af mindst 400 celler. En optimal (”ægte”) alveolær prøve vil indeholde < 5 % epitelceller 3. Diff-Quick farvning kan ikke anbefales (mast-celler vil ikke identificeres) 4. Lymfocyt subset analyse er ikke en del af den almindelige (rutine) cellulære analyse af BAL-væske

Raske (og unge) ikke-rygere Ronster LabTM Control day (n = 15) Study day 1 Study day 2 BALF Fluid input (ml) 150 Fluid output (ml) 91 (84-101) 82 (70-93) 83 (78-87) Return (%) 61 (56-67) 54 (46-62) 55 (52-58) ELF (ml) 1.14 (0.84-1.71) 1.43 0.96-1.52) 1.27 (1.04-1.60) Cell count (×104 ml-1) 171 (124-248) 222 (178-260) 220 (180-264) Macrophages (%) 90 (77-93) 86 (84-92) 89 (79-94) Neutrophils (%) 1 (1-4) 2 (1-2) Lymphocytes (%) 6 (5-14) 11 (5-13) 8 (6-17) Eosinophils (%) (0-1) Protein (g l-1) 0.1 (0.06-0.13) 0.12 (0.09-0.17) (0.09-0.15) Albumin (mg l-1) 42 (30-59) 48 (41-89) 50 (36-83) Urea (mg dl-1) 0.38 (0.30-0.59) 0.50 (0.33-0.67) 0.48 (0.38-0.51) TNF-α (pg ml-1) 0.30 (0.22-0.36) 0.32 (0.23-0-42) 0.34 (0.25-0.46) IL-6 (pg ml-1) 2.14 (1.57-2.71) 4.19 (2.93-5.53) 4.25 (2.98-5.13)

Raske (og unge) ikke-rygere Ronster LabTM Control day (n = 15) Study day 1 Study day 2 BALF Fluid input (ml) 150 Fluid output (ml) 91 (84-101) 82 (70-93) 83 (78-87) Return (%) 61 (56-67) 54 (46-62) 55 (52-58) ELF (ml) 1.14 (0.84-1.71) 1.43 0.96-1.52) 1.27 (1.04-1.60) Cell count (×104 ml-1) 171 (124-248) 222 (178-260) 220 (180-264) Macrophages (%) 90 (77-93) 86 (84-92) 89 (79-94) Neutrophils (%) 1 (1-4) 2 (1-2) Lymphocytes (%) 6 (5-14) 11 (5-13) 8 (6-17) Eosinophils (%) (0-1) Protein (g l-1) 0.1 (0.06-0.13) 0.12 (0.09-0.17) (0.09-0.15) Albumin (mg l-1) 42 (30-59) 48 (41-89) 50 (36-83) Urea (mg dl-1) 0.38 (0.30-0.59) 0.50 (0.33-0.67) 0.48 (0.38-0.51) TNF-α (pg ml-1) 0.30 (0.22-0.36) 0.32 (0.23-0-42) 0.34 (0.25-0.46) IL-6 (pg ml-1) 2.14 (1.57-2.71) 4.19 (2.93-5.53) 4.25 (2.98-5.13)

Raske (og unge) ikke-rygere Ronster LabTM Control day (n = 15) Study day 1 Study day 2 BALF Fluid input (ml) 150 Fluid output (ml) 91 (84-101) 82 (70-93) 83 (78-87) Return (%) 61 (56-67) 54 (46-62) 55 (52-58) ELF (ml) 1.14 (0.84-1.71) 1.43 0.96-1.52) 1.27 (1.04-1.60) Cell count (×104 ml-1) 171 (124-248) 222 (178-260) 220 (180-264) Macrophages (%) 90 (77-93) 86 (84-92) 89 (79-94) Neutrophils (%) 1 (1-4) 2 (1-2) Lymphocytes (%) 6 (5-14) 11 (5-13) 8 (6-17) Eosinophils (%) (0-1) Protein (g l-1) 0.1 (0.06-0.13) 0.12 (0.09-0.17) (0.09-0.15) Albumin (mg l-1) 42 (30-59) 48 (41-89) 50 (36-83) Urea (mg dl-1) 0.38 (0.30-0.59) 0.50 (0.33-0.67) 0.48 (0.38-0.51) TNF-α (pg ml-1) 0.30 (0.22-0.36) 0.32 (0.23-0-42) 0.34 (0.25-0.46) IL-6 (pg ml-1) 2.14 (1.57-2.71) 4.19 (2.93-5.53) 4.25 (2.98-5.13)

Normalværdier (raske, ikke-rygere) Ronster LabTM Makrofager > 80(85) % Neutrofile granulocytter ≤ 3 % Lymfocytter ≤ 15 % Eosinofile granulocytter ≤ 0.5(1) % Mastceller ≤ 0.5%

BAL diagnostik Interstitiel lungesygdom (ILD) Ronster LabTM Interstitiel lungesygdom (ILD) Hypersensitivitets pneumonitis (HP) Idiopatisk interstitiel pneumoni (IIP) (IPF, NSIP, DIP, RBILD, AIP, COP, LIP) Sarkoidose Akut ILD (AEP, AHP, DAH, AIP, COP) Pneumoni D+R Pneumocyster, legionella, mykobakterier Cytomegalovirus Svampe

BAL diagnostik Ronster LabTM An Official American Thoracic Society Clinical Practice Guideline: The Clinical Utility of Bronchoalveolar Lavage Cellular Analysis in Interstitial Lung Disease. Am J Respir Crit Care Med 2012: 185; 1004-1014

BAL diagnostik Ronster LabTM A: Prædominans af alveolære makrofager i BAL-væske fra et rask individ B: BAL lymfocytose An Official American Thoracic Society Clinical Practice Guideline: The Clinical Utility of Bronchoalveolar Lavage Cellular Analysis in Interstitial Lung Disease. Am J Respir Crit Care Med 2012: 185; 1004-1014

BAL diagnostik Ronster LabTM An Official American Thoracic Society Clinical Practice Guideline: The Clinical Utility of Bronchoalveolar Lavage Cellular Analysis in Interstitial Lung Disease. Am J Respir Crit Care Med 2012: 185; 1004-1014

BAL diagnostik Ronster LabTM C: Neutrofil prædominans med intracellulære bakterier (pile) D: BAL eosinofili An Official American Thoracic Society Clinical Practice Guideline: The Clinical Utility of Bronchoalveolar Lavage Cellular Analysis in Interstitial Lung Disease. Am J Respir Crit Care Med 2012: 185; 1004-1014

BAL diagnostik Ronster LabTM An Official American Thoracic Society Clinical Practice Guideline: The Clinical Utility of Bronchoalveolar Lavage Cellular Analysis in Interstitial Lung Disease. Am J Respir Crit Care Med 2012: 185; 1004-1014

BAL diagnostik E: Utilfredsstillende BAL prøve med epitelceller Ronster LabTM E: Utilfredsstillende BAL prøve med epitelceller F: Alveolære makrofager og degenererede neutrofile granulocytter (pile) An Official American Thoracic Society Clinical Practice Guideline: The Clinical Utility of Bronchoalveolar Lavage Cellular Analysis in Interstitial Lung Disease. Am J Respir Crit Care Med 2012: 185; 1004-1014

BAL diagnostik Ronster LabTM An Official American Thoracic Society Clinical Practice Guideline: The Clinical Utility of Bronchoalveolar Lavage Cellular Analysis in Interstitial Lung Disease. Am J Respir Crit Care Med 2012: 185; 1004-1014

BAL diagnostik Ronster LabTM G: Hæmosiderin-aflejring i makrofager (diffus alveolær hæmoragi) H: Pulmonær alveolær proteinose An Official American Thoracic Society Clinical Practice Guideline: The Clinical Utility of Bronchoalveolar Lavage Cellular Analysis in Interstitial Lung Disease. Am J Respir Crit Care Med 2012: 185; 1004-1014

BRONCHOALVEOLAR LAVAGE CELLULAR ANALYSIS REQUEST FORM A. Additional Information: 1. Pertinent clinical features: ______________________________________________________ 2. Radiographic/CT pattern: _______________________________________________________ 3. Preliminary diagnosis: _________________________________________________________ 4. Drug-induced? _______________________________________________________________ 5. Lung (R or L) and area lavaged (e.g. RML, lingula, etc.): 6. Total volume instilled (mL): __________________________ 7. Total volume of BAL fluid retrieved (mL): ____________________ 8. Volume of BAL fluid sent to laboratory: _____________ B. BAL cell analysis is optimal if an adequate volume (e.g. 10-20 mL) is available for testing. If BAL volume is limited, please identify tests that must be performed and prioritize your requests. ____ Cell count and differential (Wright-Giemsa stain) ____ T lymphocyte subsets by flow cytometry ____ Hemosiderin stain ____ Other testing (specify): ______________________________________ C. Tests for infectious agents: use separate microbiology forms as needed D. Malignancy suspected? Send aliquot to pathology D. Specimens must be promptly transported to the laboratory at room temperature and must not be frozen. If not analyzed immediately, BAL cell suspensions can be kept at 4°C for up to 1 hour in nutrient poor media (normal saline). Specimens for BAL cellular analysis can be maintained in nutrient supplemented media for up to 24 hrs.

BRONCHOALVEOLAR LAVAGE CELLULAR ANALYSIS FINAL REPORT FORM General Information: 1. Volume of original BAL fluid received and analyzed: ____________ 2. Appearance of original BAL fluid (color and turbidity): ______________ 3. BAL cell profile: Viability of nucleated cells (% of total): ________ Total nucleated cell count (per μL) ________ Macrophages (% of differential) ________ Lymphocytes (% of differential) ________ Neutrophils (% of differential) ________ Eosinophils (% of differential) ________ Epithelial cells (% of differential) ________ - Type: squamous ___ bronchial ___ Mast cells (% of differential) ________ Other cell type (% of differential) ________ - Type: _________________ Flow cytometry: % CD4 positive ________ % CD8 positive ________ CD4/CD8 ratio ________ BAL cell profile reference values: % Macrophages [80-100] % Lymphocytes [0-15] % Neutrophils [0-3] % Eosinophils [0-1] % Epithelial cells [0-5] CD4/CD8 ratio [0.9-2.5] BAL cell profile interpretation: Sample adequate? Yes No