En biokemisk karakterisering af et hvilket som helst protein kræver at vi har noget rimeligt rent, oprenset aktivt protein. Oprensning kræver vi har et assay for at kunne følge aktiviteten under oprensingen For enzymaktiviteter, der kræver flere proteiner, er det generelt vigtigt, at kunne oprense de enkelte komponenter i en ren form og rekonstituere systemet

Sammensætning af holoenzym og coreenzym ion bytter kromatografi adskiller s fra de øvrige komponenter

Transkriptionsaktivitet af holo- og coreenzym

Typer af virale gener

Eksperimentelle grundlag for holoenzymets specificitet

Promiskøs transkription mærket in vitro fremstillet RNA kompetition med forskellige gener Specifik transkription mærket in vitro fremstillet RNA kompetiton med forskellige gener

Kun specifik transkription af holoenzymet vises ved RNase protection Core enzymet transkriberer begge strenge promiskøst

Holoenzymet binder hårdt til promotorer i modsætning til coreenzymet Tidsskale for udbytning af radioaktiv promotorsekvens med den samme kolde sekvens

reverse

DNA smeltning fremmer binding af holoenzymet tyder på at denaturering fremmer binding af holoenzymet

Promotor genkendelse og aktivering

Promotor struktur bioinformatisk analyse mutationsanalyse

Stærke promotorer indeholder UP elementer samt -10 og -35 sekvenser

Abortiv initiering 1, - DNA 2, +[32P]-a ATP RNA polymerasen prøver flere gange, mens den bliver siddende på DNAet 1, - DNA 2, +[32P]-a ATP 3, +[32P]-a ATP + 25mM CTP, GTP, UTP 4, +[32P]-a ATP + 50mM CTP, GTP, UTP 5, +[32P]-a ATP + 100mM CTP, GTP, UTP 6, +[32P]-a ATP + 200mM CTP, GTP, UTP 7, +[32P]-a ATP + 400mM CTP, GTP, UTP

Overordnet billede af transkriptionsinitiering

Rifampicin forsøg viser at initieringsfrekvensen øges stimulerer elongering eller initiering ? Rifampicin inhiberer initiering af transkription i prokaryoter Rifampicin forsøg viser at initieringsfrekvensen øges

s kan genbruges Lav ionstyrke forhindrer terminering rifampicin + core nye core fra rifamipicin resistent stamme

Oprindelig model for genbrug af s

Princippet i FRET

Fluorescent resonanse energy transfer Bruges til at bestemme om to molekyler er tæt på hinanden eller bevæger sig mod/bort fra hinanden.

Resultatet af FRET analyse på s og DNA Ikke alle s-faktorer forlader RNA polymerasen

Sammensætning af RNA polymerasen under elongering Pause ved +32 Oprensning v.h.a. Beads med komplementær oligo nuklease behandling og SDS PAGE

Smeltning af dobbelstrenget DNA giver en stigning i absorbancen ved 260 nM (hyperkromisk skift) Hybridisering af to enkeltstrengede DNA molekyler giver et fald i absorbancen ved 260 nM (hyopokromisk skift) Ændringen i absorbancen er et mål for hvor mange hydrogenbindinger der dannes/brydes. På en DNA template med RNA polymerase giver en sådan analyse ca. 10 baser separares.

Udstrækning af enkeltstrenget DNA i promotoren

Konserverede regioner i s-faktorer

Competition forsøg med filter bindings assay GST-fusioner kan bruges til at bestemme hvilke områder af s der binder -10 eller -30 regionerne Competition forsøg med filter bindings assay Competition i fravær af enten -10 eller -35 Competition uden både -10 og -35

Crosslinking kan bruges til at vise hvilke regioner af b’ der er vigtig for binding af s til promotoren (-10 regionen)

In vitro transkription med vildtype og muterede a-dele af RNA polymerase holoenzym SUB, UP elementet substitueret med en tilfældig sekvens -41, mangler UP elementet RNA1 fra vektoren

Foot-printing kan buges til at vise, hvor et protein binder DNA a, template streng b, non-template streng a2, a-subunit dimer RNAP, holoenzyme

(f.eks. hvilke subunits har betydning for antibiotike resistens) Rekonstitueering fra rene komponenter kan give information om molekylære reaktionsmekanismer (f.eks. hvilke subunits har betydning for antibiotike resistens) Fraktionering af core-enzymet

b-sununit vigtig for både rifampicin og streptoglydin resistens Rifampicin hæmmer initiering Streptoglydin hæmmer elongering

Affinitetsmærkning kan bruges til at identificere det aktive site i et enzym Ved at reagere RNA polymerasen med umærket affinitetslabel og mærket nukleotid sikres at mærkningen sker i det aktive site i RNA polymerasen

b er en del af det aktive site for dannelse af fosfordiester bindinger

Indkorporering af 6-10 histidiner kan bruges til affinitets- oprensning af proteiner og til at immobilisere dem og manipulere med substratet. En enkelt strenget sekundær template virker ved lav ionstyrke Mindst 9 bp dobbelstrenget DNA kræves for salt resistent binding mellem position +2 og + 11

Crosslinking via iodo-deoxyuridin holding sekundær template

Crosslinking mellem DNA og RNA kan bruges til af vise hvor lang DNA-RNA hybriden er under elongering

Crosslinking til at bestemme udstrækningen af RNA-DNA hybrider under elongering Indkorporering af reaktiv uridin base i RNAet på en bestemt position. Dernæst tillade RNA polymerasen at polymerisere til en defineret position fra den reaktive uridin. dernæst aktivere krydsbinding.

Transkription påvirker supercoiling af DNAet

In vitro ssystem for at bestemme kravene til transkriptions terminator

Model for terminering

Magnetiske beads kan bruges til at separere reaktionsprodukter Template koblet til magnetiske beads Frigives RNAet, som tegn på terminering, ender det i supernatanen, ellers i pellet Dobbeltstrenget RNA vigtig for terminering

g-fosfatet indkorporeres kun i den første nukleotid 3H-mærket UTP indkorporeres i alle polymeriserede nukleotider

Ultracentrifugering eller elektroforese kan bruges til at adskille RNA efter størrelse Forskellei størrelse mellem RNA lavet i fravær/tilstedeværelse af rho

Sedimentation af RNA lavet i fravær af rho eller i tilstedeværelse rho frigiver RNAet fra DNAet

Model af rho afhængig terminering