Genom-screening med Illumina SNP-array Beskrivelse af beadchippen Princippet bag detektion af variationer med SNP-array SNP-array fremgangsmåde Eksempler på resultater Klinisk Genetisk Afdeling, Laboratoriecenteret, Sygehus Lillebælt, Vejle

Hvad kan vi bruge genom-screening med SNP- array til? Genom-screening med array bygger videre på den traditionelle kromosomundersøgelse (båndfarvnings-analyse). Array-teknologien er i stand til at detektere sygdomsgivende variationer/ubalancer (deletioner og duplikationer) ned til en størrelse af ca. 50 kb og har ca. 200 gange så høj opløsning som en traditionel kromosomundersøgelse. Array-teknologien kan ikke detektere balancerede translokationer og inversioner Hele genomet screenes i en undersøgelse Båndfarvning 14 Mb deletion SNP-array 2,6 Mb duplikation

Array analyse på Klinisk Genetisk Afdeling Vejle Det humane genom publiceres Oligo-array introduceres 2x100.000 prober pr. patient 2003 2007 2008 2009 2010 2011 Opstart BAC-array 2x4500 prober pr. patient SNP-array introduceres 300.000 unikke prober pr. patient

Illumina HiScanSQ maskinen kan både udføre Next-Gen Illumina HiScanSQ maskinen kan både udføre Next-Gen. Sekventering og SNP-array

Illumina Human CytoSNP-12 v2.1 Beadchip 12 patienter pr. Beadchip/kørsel Input: 200 ng DNA Fokus på 250 syndrom områder samt 400 sygdomsrelaterede gener Detektion af deletion, duplikation, loss of heterozygosity, uniparental disomi, nært slægtsskab hos patientens forældre samt mosaikker Pris 800 kr pr. patient (beadchip + reagenser; ca. 1500 kr inklusiv arbejdstid) Kan relativt nemt opskaleres til 48 patienter pr. kørsel

Bead design Beadstørrelse 2um Identifier Specifik sekvens Beadstørrelse 2um Hver DNA-sekvens består af en adresse kode der identificerer den enkelte bead samt en sekvens der er specifik for et enkelt område på genomet og er lokaliseret til et SNP-site Hver enkelt bead er coated med ca. 800.00 ens DNA-sekvenser

Bead design Beadstørrelse 2um Hver DNA-sekvens består af en adresse kode der identificerer den enkelte bead samt en sekvens der er specifik for et enkelt område på genomet og er lokaliseret til et SNP-site Hver enkelt bead er coated med ca. 800.00 ens DNA-sekvenser

Beadchip design

Beadchip design

12 billeder pr. subarray 12 subarrays pr. slide 144 billeder totalt (x2) 2,4 cm

SNP-array princip Hvordan bruger vi SNPs til at detektere deletioner og duplikationer i det humane genom?

Hvad er en SNP? ATTACCGAGAAGGCCGAAG TAAGGCCGAAGAGTTGAGG A C SNP står for single nucleotide polymorphism; altså en variation af en enkelt base i det humane genom (fx kromosom 1 basepar position 4256335 der har de fleste et A mens nogle har et C) Der er SNPs spredt ud over hele det humane genom

SNP-array princip A og T = A C og G = B Person 1 Person 2 Person 3 Informativ SNP! Person 1 Person 2 Person 3 Person 4 Person 5 Person 6 Person 7 Person 8 Person 9 Person 10 ABBAABABAAABABBBABABBBBAAAABBABAAABABBABAAB ABBAABABAAABABBBAAABBBBAAAABBABAAABABBABAAB ABBAABABAAABABBBABABBBBAAAABBABAAABABBABAAB ABBAABABAAABABBBAAABBBBAAAABBABAAABABBABAAB ABBAABABAAABABBBAAABBBBAAAABBABAAABABBABAAB ABBAABABAAABABBBABABBBBAAAABBABAAABABBABAAB ABBAABABAAABABBBABABBBBAAAABBABAAABABBABAAB ABBAABABAAABABBBAAABBBBAAAABBABAAABABBABAAB ABBAABABAAABABBBAAABBBBAAAABBABAAABABBABAAB ABBAABABAAABABBBABABBBBAAAABBABAAABABBABAAB ABBAABABAAABABBBABABBBBAAAABBABAAABABBABAAB ABBAABABAAABABBBAAABBBBAAAABBABAAABABBABAAB ABBAABABAAABABBBABABBBBAAAABBABAAABABBABAAB ABBAABABAAABABBBAAABBBBAAAABBABAAABABBABAAB

Sortering af SNPs giver normalt 3 udfaldsgrupper A/B B B B B B B B B B B B B B BB B BB B B BB BB A AA AA A AAA A A A A A A A A A A A A B ABA ABABBB AB B AA AB A BA A B A ABA BBA BA A B B A BAB BABAAA BA A BB BA B AB B A B BAB AAB AB B A B

Regioner med deletion har kun 2 udfaldsgrupper A/B B B B B BB B B BB B BBB B B BB B BB B B BB BB B B B B B B BB B BB B B BB BB A AA AA AA A AAA A A AA A A A A A A A A A A AA AA A A A A A A A A A B ABA ABABBB AB B AA A ABA BBA BA A B B A BAB BABAAA BA A BB B BAB AAB AB B A B

Regioner med duplikation har 4 udfaldsgrupper A/B A B A A A A A A A A A A A A A A A A A AA A A A A A A A A A A B BA AB A ABBAB A BB B B AB BB B BBABA B BA B A BB BA B BABBB B AB AA B B A B A AB A A A A B BA A A B A A B BB B BB B BB B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B A B A B A B A B A B A B A B A B B

Ved at måle SNP signaler kan vi detektere regioner med hhv Ved at måle SNP signaler kan vi detektere regioner med hhv. deletion og duplikation A B A B A B Normal Deletion A B A B Duplikation A B A B A B A B

SNP-array fremgangsmåde Detektion og kvantificering af A og B SNP signaler

SNP-array fremgangsmåde Blodprøvetagning DNA-oprensning Amplifikation Fragmentering Hybridisering

Hybridisering G G C T A A

Enkelt-base extension C G Biotin-labelled ddNTPs A T Dinitrophenol-labelled ddNTPs G C C G C G A T A T T A

Vask C C G A T T

Farvning Streptavidin-GREEN Anti-DNP-RED C C G A T T

Anti-streptavidin-biotin Forstærkning Anti-Ab-DNP C C G A T T

Streptavidin-GREEN Anti-DNP-RED Farvning 2 C C G A T T

Scanning

Måling af GRØN og RØD signal intensitet for hver enkelt bead C C G A T T A B A B A B

2,6 MB deletion på kromosom 22 22q11.2 deletions syndrom 2,6 MB duplikation på kromosom 22 22q11.2 duplikations syndrom