Lektion 10: Kromosomer og kromosomfejl Fremstilling af kromosom-præperater Normale karyotyper fra husdyr Kromosomfejl hos husdyr Identifikation af kromosomer med kromosom paint Kromosomfejl påvist ved DNA-indhold i sædceller Nyheder indenfor forskning Denne lektion vil omhandle Kromosomer og kromosomfejl. med bl.a. en beskrivelse af fremstilling af kromosom-præperater fra lymfocyt og andre cellekulturer samt farvemetoder for kromosom-præperater. Der vil ligeledes blive givet en beskrivelse af de normale karyotyper fra husdyr. Hver husdyrart har specifikke kromosomer både med hensyn til form og antal. Antallet går fra minkens 30 til hundens 78. Der er som regel flere kromosomer når de er acrocentriske. Det passer rimeligt godt for hunden har næsten kun acrocentriske, hvorimod mink næsten kun har metacentriske kromosomer. Lektionen vil også omhandle kromosomfejl hos husdyr. Og der vil også blive givet en beskrivelse af identifikation af kromosomer med kromosom paint. Hvert af de humane kromosomer er tilgængelige som rent DNA, det kan anvendes til at identificere tilsvarende kromosomer hos andre dyrearter incl. husdyr. Sidst men ikke mindst vil der blive behandle emnet kromosomfejl påvist ved DNA-indhold i sædceller. Ved flow cytometri kan sædceller sorteres i henhold til DNA inhold. Der er 4 % forskel I DNA indhold mellem sædceller der indeholder et Y og dem der indeholder et X chromosom. Tilsvarende viser kromosomfejl sig ved at handyret producerer sædceller med ukorrekt DNA indhold.

Fremstilling af præperater Dyrkning af lymfocytter Høst af celler Farvning Dyrkning af andre celler Det er kun under cellens metafase, at kromosomerne bliver synlige og egnede for den klassiskekromosomanalyse. Da metafasen er meget kortvarig, er det nødvendigt at have celler i stærk vækst for at kunne fremstille gode kromosompræperater. Lymfocytter kan hos de store husdyr nå op på høje mitose-rater ved stimulation med et stærkt mitogen, der anvendes sædvanligvis PHA (pytha-heamaglutinin). Dyrkningen sker fra heparinstabiliserede blodprøver, der kan fremsendes med post. Dyrkningen skal starte indenfor 5 dage efter prøvetagningen og den varer normalt tre dage (60 til 70 timer) ved 38 grader før cellerne kommer i deling. For at akkumulere mange metafaser anvendes tilsætning af colcemid de sidste 2 timer før høst. Høsten afsluttes med vask og fixering af cellerne i metanol-isæddike I forholdet 3:1. Farvning kan ske med alle kendte kernefarvestoffer, som feks. Giemsa og Acridin orange. Kromosomer der har fået inkoorpereret brom-deoxy-urasil, i de sidste 6.5 timer før høst vil udvise replikationsbånd. Båndene anvendes til identifikation af de enkelte kromosompar efter farvning med acridin orange. De tidligt replikerende bånd er lyse, mens de sent replikerende bånd er gråbrune. Man anvender også andre celler typer end lymfocytter til dyrkning og senere studie af kromosomer. Man kan dyrke fibroblaster fra skind, men dyrkningen skal ske indenfor de første 12-15 timer efter udtagning . F.eks et øreklip er let at anvende og forsende.

Fremstilling af præperater Hypotonbehandling Fixering af celler Air drying teknik Ved hypoton behandlingen svulmer cellerne op til dobbelt størrelse før celle membranen brister Lige før celle membranen brister Fikseres cellerne og vaskes mange gange med fikservæsken, så alle salte og de fleste af proteinerne vaskes væk. Der er nu kun tilbage et skelet der holder sammen på kromosomerne. Når den fikserede celle suspension droppes ud på et objektglas fordamper fikservæsken, og kromosomerne lægger sig I et plan, hvor alle kromosomer kan studeres samtidig.

Normale karyotyper, svin 2N = 38, XX Her er vist normale karyotyper fra en so. Karyotypen hos svin er 2N= 38 inkl. XX kromosomet i dette tilfælde. Svin har 6 par acrocentriske og 12 par metacentriske autosomer, X-kromosomerne er ligeledes metacentriske. Nederst til højre på billederne er vist den orginale celle, hvorfra kromosomerne er klippet ud og sat op. Bemærk især, at det ene X kromosom er inaktiveret, hvilket fremgår af den blege farve. Farvemetoden er som for kvægets vedkommende Acridin orange efter brom-deoxy-uracil inkoorporation.

Normale karyotype, kvæg Antal kromosomer: 2N = 60, XY Her er vist normale kromosmer fra en tyr. At det er en tyr ses af kromosomparret i nederste højre hjørne, hvor Y kromosomet er noget mindre end X-kromosomet. Når kromosomerne er båndfarvede, kan de sættes op parvis, som vist her for kvægets kromosomer. De er sat op ifølge internationalt anerkendte nummereringsmetoder. Nummereringsmetoderne går i store træk ud på at ordne dem efter størrelse og/eller centromerets placering. Indenfor hvert kromosompar stammer det ene fra dyrets far og det andet fra dyrets mor. Kvæg har mange acrocentriske kromosomer. Alle autosomerne , 29 par, dvs. 58 kromosomer, er acrocentriske og det er kun X og Y der metacentriske. Der er stor lighed mellem kvægets kromosomer og kromosomerne fra får og ged. Geden har 60 kromosomer, der stort set er identisk med kvægets lige bortset fra kønskromosomerne X og Y. X-chromosomet hos ged er acrocentrisk og Y-chromosomet er meget mindre end kvægets. Hos får er der de samme forskelle med hensyn til kønskromosomerne, men herudover er der sket 3 centromerfusioner for kromosomerne 1/3, 2/8 og 5/11 i forhold til kvæg og ged, derfor har får 54 kromosomer. Der kan forekomme normale fertile afkom efter en parring mellem en hun ged og et han får, hvorimod fostrene dør i den omvendte kønskombination. Drægtighedstidens længde er næsten identisk for får og ged ca. 148 dage.

Normale karyotyper, kat XY Katten har 38 kromosomer ligesom hos svin. De er alle er metacentriske, og der er på ingen måde anden lighed mellem katte og svinets kromosomer. Minken har 30 kromosomer hvor et par er acrocentriske, der er 3 par af kattens kromosomer der har stor lighed med minkens kromosomer Karyotypen hos hest er 2N= 64 Heste har 18 par acrocentriske og 13 par metacentriske autosomer, X og Y chromosomerne er ligeledes metacentriske. Æslet har 62 kromosomer der er ret forskellige fra hestens. Muldyr er en infertil krydsning mellem hest og æsel. Hund og ræv er genetisk set meget nært beslægtede, men på kromosomnieau er de meget forskellige. Rødræv har 34 kromosomer + 1 til 5 mikrokromosomer Blåræv har 50 kromosomer Hunden har 78 kromosomer, alle autosomer er acrocentriske Der kan forekomme nonfertile afkom efter en parring mellem de to rævearter, og drægtighedstidens længde er næsten identisk for de to arter ca. 58 dage.

Indikation for kromosom undersøgelse Fertilitets problemer Nyfødte med multiple misdannelser Den vigtigste indikation for en kromosomundersøgelse er manglende eller nedsat fertilitet. Ved nedsat fertilitet er der altid et ønske om at få klarlagt årsagen. Det er kendt at en translokation nedsætter fertiliteten med op til 50 procent. Det er ligeledes kendt at hopper med anormale kønskromosomer næsten altid er sterile. Dukker en given misdannelse op gentagne gange indenfor en familie kan der være tale om kromosomfejl.

Kromosomfejl, kvæg Trisomi 22, 2N = 61, XX Translokation 1-8, 2N = 60, XY Nu skal vi gå lidt i dybden med kromosomfejl. Såfremt et individ ikke har et balanceret kromosomsæt med to kromosomer i hvert par, vil det normalt give sig til kende på dyrets phenotype med afvigende egenskaber. Og dyr med et ubalanceret kromosomsæt vil almindeligvis være sterile og ofte have nedsat livskraft. Trisomier er kendt fra mennesker hvor trisomi 21 giver anledning til Downs syndrom, med nedsat vækst og retardering tilfølge. Trisomier er sjældne hos husdyr, men forekommer nu og da så det er en mulig diagnose i forbindelse med utrivelige dyr med afvigende phenotype. Dyr, der har et balanceret kromosomsæt, vil være phenotypisk normale. Dvs. De har det rigtige antal kromosomstumper. Disse kan bare være sat sammen på underlige måder. Kromosomfejl hos dyr med normal phenotype bliver normalt opdaget ved at f.eks. en tyr har alt for lav fertilitet, karyotypen fra en sådan tyr er vist på billedet til højre. Tyren havde meget stærk nedsat fertilitet, der blev født 10 kalve efter mere end 200 insemineringer

Mindre grove kromosomfejl Kendte centromer fusioner Kvæg 1/29 Blåræv 23/24 Svin 14/16 Tæve kromosomtal Antal kuld Kuldstørrelse 48 16 11,9 49 42 9,8 50 17 11,2 En centromerfusion hos heterozygot nedsætter fertiliteten ca 10 % Kromosom 1 og 29 Fusion 1/29 Hos mange af vore husdyr findes mindre grove kromosomfejl. De består eksempelvis i at to acrocentriske kromosomer fusionerer. Dette kaldes en centric fusion. Den mest kendte er 1/29 centromer fusion mellem kromosom 1 og 29 hos kvæg. Når en sådan fusion forekommer i heterozygot form, giver den anledning til svagt nedsat fertilitet, i størrelsesorden af 10 procent, når det drejer sig om omløberprocent. Er der kun et af kromosomerne der er fusionerede, giver dette anledning til problemer ved kønscelledannelsen, da nondisjunktion er hyppigere end hos normale individer. En tilsvarende centromerfusion findes hos blåræve, og her er effekten af samme størrelsesorden, når det drejer sig om kuldsstørrelse. Heterozygoterne har en nedsat kuldstørrelse på ca. 10 % i forhold til de to homozygoter som det fremgår af tabellen.

Mindre grove kromosomfejl Centromerfusion hos blåræv Her er vist centromerfusionen der findes hos blåræve. Dyr med 50 kromosomer har 4 akrocentriske kromosomer Dyr med 49 kromosomer har 2 akrocentriske kromosomer og et fusioneret kromosom Dyr med 48 kromosomer har ingen akrocentriske kromosomer og to fusionerede kromosomer

Mindre grove kromosomfejl Kønskromosomfejl: XY, XXX og X0 hopper Blodkimærer hos kvæg tvillinger: Tyrekvier Kønskromosomfejl hos hopper er ikke en usædvanlig hændelse. Hopper med XY kønskromosomer er ret almindelige i visse halvblodsracer. Endvidere findes der en del hopper med XO eller XXX kønskromosomer. Et kendt eksempel på en kromosomafvigelse er tyrekvier (også kaldet FreeMartins). Kromosomundersøgelse kan anvendes til at påvise, at der har fundet en sammensmeltning sted af de placentale blodbaner hos tvillinger af forskelligt køn hos kvæg. Sammenblandingen giver sig udslag i, at der kan etableres stamceller for hvide og røde blodlegemer fra begge dyr med proportioner gående fra 0 til 100 procent af den rigtige 'type'. Sammenblanding kan give anledning til at kviekalven får misdannede kønsorganer 'en tyrekvie' og dermed bliver infertil. Tyrekalven har normal fertilitet, men i forbindelse med faderskabssager, der normalt gennemføres på blodprøver, får man på grund af kimerismen ikke entydige resultater. Ved blodprøvetagning til faderskabssag bør det derfor oplyses, såfremt kalven er en tvilling. .

Imprinting, kromosomfejl Uniparental disomi Ved uniparental disomi er der tilsyneladende ikke tale om kromosomfejl, men dyrene bliver ikke altid normale. Det skyldes et fænomen der kaldes imprinting. Fænomenet er undersøgt grundigt hos mus, da man ved hjælp af centromer fusioner forholdsvis let kan fremstille mus der enten har maternel eller paternel disomi. Man har fundet, at for ca. halvdelen af musens kromosomer er det nødvendigt, at der skal være et maternelt og et paternelt kromosom i et par for at individet kan udvikle sig normalt. Man ved i øvrigt, at den hanlige del er vigtige for placentadannelsen mens den hunlige del er vigtige for embryo udviklingen. På grund af imprinting fænoment er det yderst vanskelig af få normal fosterudvikling i forbindelse med kerne transplationer (såkaldt kloning). .

Kromosom paint Identitet af et kromosom eller kromosom- stykke påvises vha. kromosom paint Anvendelse af artsspecifikke prober: cDNA, cosmider, bac kloner etc. Anvendelse af kromosomspecifikke biblioteker (paints): Artsegne (Homolog) Fremmed art (Heterolog) Identitet af et kromosom eller kromosom-stykke kan påvises v.h.a. kromosom paint. Paint sker ved anvendelse af en temmelig stor, komplementær probe. Proben kan hybridisere til store DNA-områder, som man så kan iagttage. Proberne man kan anvende kan f.eks.være cDNA, cosmider eller bac kloner. Der er ved at blive oparbejdet prober fra specifikke husdyr kromosomstykker, men det må formodes, at der går en rum tid før f.eks. alle grise og kvæg kromosomer er tilgængelige. Bibliotekerne kan være artsegne, homologe, eller de kan komme fra en anden art, heterologe. Med heterologe prober kan man undersøge om der er fælles gener i to forskellige arter.

Kromosom paint, metoder Opmærkning af probe med biotinilerede nucleotider Smeltning af probe og mål-DNA (kromosomer) Hybridisering under dækglas i op til flere døgn Afvaskning af overskydende probe Et lag af avidin (avidin binder meget stærkt til biotin) Farvning - fluorescens mærket antistof mod avidin Paint metode er i store træk følgende (Fluorescens in situ hybridisering, FISH): Opmærkning af probe med biotinilerede nucleotider Smeltning af probe og mål-DNA (kromosompræperatet) Hybridisering af probe og mål-DNA under dækglas i op til flere døgn Afvaskning af overskydende probe Et lag af avidin (avidin binder meget stærkt til biotin) Farvning ved hjælp af fluorescens mærket antistof mod avidin Fotografering v.h.a. fluorescens mikroskop

Kromosom paint: Grise Eksempel Anvendelse af svine kromosom 12 p-arm fra bibliotek på svinekromosomer Bagrundsbillede: To gule pletter er p-armen på svinets kromosom 12 Til paint kan man f.eks. anvende kromosoms 12s p-arm, der findes i et bibliotek, dvs. en samling af kendte sekvenser. Baggrundsbilledet viser faktisk en sådan paint De to gule pletter er p-armen på svinets kromosom 12, der har anealet sig med proben. På det sort-hvide billede kan man se den samme paint med to farvede kromosom-stykker. DNA fra kromosom 12-p-armen, altså proben, har været opmærket med biotin, der efter aneling til kromosomerne er påvist vha. avidin, der binder meget hårdt til biotin. Den endelige påvisning sker vha. FITC-mærket anti-avidin. Billedet af painten kan så tages med et flourescence mikroskop med farve film. Sort/hvid billede af samme paint med to farvede kromosomstykker

Kromosom paint: Human Eksempel De humane kromosomer painted med hver sin farve Metafase Karyotype Her ses et paint, hvor alle de humane kromosomer er anvendt som prober på netop de humane kromosomer. Proberne er mærket med hver sin farve. Som det ses i nederste billede kan en translokation erkendes med kromosom paint, selv om det kun drejer sig om et lille stykke. Translokationen er det lille stykke med blå farve på det gule kromosom og omvendt. Sort/hvid billede og paint med to farvede kromosomer med en translokation

Kromosom paint Eksempel med mink cosmid Kromosom paint - Eksempel på mink cosmid: For at identificere et gens placering på et specifikt kromosom anvendes artsspecifikke prober, herunder cDNA og cosmider, bac kloner På billedet er der anvendt mink cosmid nr 73 (proben), der stammer fra et mink bibliotek Et cosmid er lidt større end et plasmid, plasmider kan indeholde op til 10 kilo base par DNA mens et cosmid kan indeholde op til 50 kilo base par DNA. I den almene genetik er det omtalt i detaljer, hvorledes plasmider bruges til opformering af specifik DNA. Der er sat en hvid streg ud for signalerne, cosmiderne. Som det ses, er der to signaler på begge kromosom nummer 3’s q-arm. Det skyldes, at kromosomerne er i metafase. Dvs. de er i stadiet lige før deling. Derfor ses der et signal på begge strenge på kromosomet.

Eksempel på heterolog paint Mink 13 Human 14 probe Kromosom paint, Eksempel på heterolog paint På det højre billede kan man se anvendelse af human kromosom 14 paint på mink metafase kromosomer. Identifikation af de samme minkkromosomer farvet med DAPI er vist i venstre billede. Det paintede område er indikeret med en pilespids. Og resultatet er, at kromosom 14 hos mennesker, proben, er homolog med nederste halvdel af minkens kromosom 13 q-arm. Gennemføres der en tilsvarende paint med alle de humane kromosomer få man en tabel over identitet mellem mink og humane kromosomer. - Et sådan homologi kort eksisterer for både, kvæg, svin, kat, hest og mink. Ved hjælp af et sådant kort kan der findes identitet mellem kromosomer hos forskellige arter, og på denne måder er det vist, at der er 3 næsten identiske kromosomer hos kat og mink Desuden kan det nævnes at human kromosom 17 svarer til: MINK CAT SVIN KVÆG 5q 14 12 19

Kromosom paint Eksempel med grise BAC på X-chromosom Kromosom paint - Eksempel på grise bac: For at identificere et gens placering på et specifikt kromosom kan anvendes artsspecifikke prober, herunder cDNA og cosmider, bac kloner På billedet er der anvendt en grise BAC (proben), der stammer fra et grise bibliotek En BAC kan indeholde op til 150 kilo base par DNA. Der er sat en hvid streg ud for signalerne, cosmiderne. Som det ses, er der to signaler på begge kromosom nummer 3’s q-arm. Det skyldes, at kromosomerne er i metafase. Dvs. de er i stadiet lige før deling. Derfor ses der et signal på begge strenge på kromosomet.

Kromosomfejl påvist ved DNA-indhold i sædceller Flow-cytometri på sædceller 4% afvigelse { Y X Ved flow-cytometri måles indholdet af DNA for f.eks. En celle. På figuren er vist DNA indholdet for 3000 sædceller fra en orne. Ved flow-cytometri målingen kan der på normale individer påvises to klasser af sædcelle, som afviger i DNA-indhold på ca 4 % for alle pattedyr husdyrarter Disse to klasser skyldes at halvdelen af sædcellerne indeholder et X kromosom og halvdelen et Y kromosom. De to klasser er vist i grafen for en orne hvor der er sorteret ca 3000 sædceller, forskellen mellem de to toppe er ca 4 %. Og som man kan se på skalaen, er man i området omkring 400 enheder.

Kromosomfejl påvist ved DNA-indhold i sædceller Ved flow-cytometri på sædceller fra dyr med kromosomfejl bliver der ikke kun to klasser af sædceller, da sådanne dyr giver anledning til meiose fejl med nondisjunktion til følge, så nogle sædceller mangler et kromosom og andre har et for meget DNA indhold i sædceller fra en orne med en translokation er vist i grafen. Translokationen er vedr. kromosom 1 og 17. Når denne orne danner sædceller, vil der ske fejl med hensyn til disse to kromosomer. Kromosom 1 er et meget stort kromosom der repræsenterer ca. 9 procent af en sædcelles DNA. Derfor ses der i denne ornes histogram to ekstra toppe symmetrisk en på hver side. Den lille ekstra top til højre svarer til sædceller med to kromosom 1'er, mens toppen til venstre svare til sædceller med intet kromosom 1. De to ekstra toppe kommer kun frem henholdsvis sammen med et X- og sammen med et Y-kromosom. Et ekstra eller tab af kromosom 17 er ikke direkte synligt, da dette kromosom er et lille kromosom, der udgør ca. 2 procent af sædcellens DNA-indhold. Men set I forhold til kontroldyret på foregående graf er adskillelsen af de to toppe dårliger, mellemrummet er fyldt op med celler der har et for lidt eller et for meget af kromosom 17.

Mink kromosom 8 specifik probe Kromosomspecifikke DNA-prober til påvisning af non-disjunktion i sædceller Mink kromosom 8 specifik probe På billedet er vist resultater fra en Mink-kromosom-8-specifik probe anvendt på sædceller. Som det ses, er der et signal på hver sæd celle. Der er dog en enkelt celle med to signaler. Det er resultatet af en nondisjunktion begivenhed. Det betyder, cellen indeholder 2 udgaver af kromosom 8. Efter in situ hybridicering til udstrygningspræparat af sædceller og efterfølgende påvisning af tilstedeværelse af signal, er det muligt at påvise sædceller med 0, 1 (normal) eller 2 af det pågældende kromosom, afhængigt af antallet af positive hybridiceringsområder. Undersøgelser fra mennesker giver skøn for non-disjunktion-fejl i sædceller, der ligger I størrelsesorden 5-8 procent for normale individer. Dette svarer til en fejlprocent på ca. 0,2 for hvert kromosompar. Da fostre med forkert kromosomtal stort set alle går til grunde, kan den maksimale fertilitet beregnes til ca. 85 %, idet der regnes med samme fejlprocent hos både hanner og hunner. Det skal nævnes at det er kendt, at den maksimale klægningsprocenten hos høns er omkring 83 %.

Kromosomspecifikke DNA-prober til påvisning af non-disjunktion i sædceller I nærværende tabel er der vist preliminære resultater fra mink. Undersøgelser fra mennesker giver skøn for non-disjunktion-fejl i sædceller, der ligger I størrelsesorden 5-8 procent for normale individer. Dette svarer til en fejlprocent på ca. 0,2 for hvert kromosompar. Mink resultaterne svarer meget godt til resultaterne fra mennesker. Så den absolut højeste fertilitetsrate kan beregnes til at ligge omkring 85 % da man må påregne det samme antal non-disjunktion begivenheder hos hunkøn.

Ploidi hos embryoner undersøgelser vha. kromosom specifikke prober Viuff et al. 2000, Biol. Reprod. 63: 1143-48

Aneuploidi hos fostre Problemer med spindel hos hunlig meiose Nondisjunktion, Fra Science 2002, vol 296,2164

Maternelle celler hos foster. Kan give anledning til autoimune sygdomme A boy with juvenile dermatomyositis hosts a blue-stained white blood cell (right) with two X chromosomes (pink) and no Y chromosomes (green). Fra Science 2002, vol 296,2171 Cells Exchanged During Pregnancy Live On

Meiotic recombination, synaptimal complex From Genetics 162:297-306, 2002

Number of recombinations per spermatocyte depending on mouse strain

Non random inactivation or asynchronous replication

Synaptimal complex chiasma protein Am J Hum Gen 71:1353, 2002