Efteruddannelse i Bioteknologi Kursus A Genteknologiske metoder
Kursus indhold
Gelelektroforese
To formater – to geler Agarose-gelelektroforese horisontal elektroforese 100 – 10.000 bp Elektroforese ≈ 1 time Polyakrylmid-gelelektroforese oftest vertikal elektroforese 10 – 1000 bp Elektroforese ≈ 1 – flere timer
Agarosegel
Agarose
Støbning af gel
Polyacrylamid
Visualisering Ethidiumbromid SYBR safe SYBR Green, Red, Orange Fast Blast (Coomassie?) Southern blot (DNA) Northern blot (RNA)
Visualisering Ethidiumbromid
SYBR Safe…
FastGel system
Southern blot
Northern blot
Gel-oprensning Agaroseelektroforese Udskæring af ønsket bånd ”Smeltning” af båndet med guanidinium thiocyanat Adsorption på silica-kolonne Eluering fra kolonne med vand eller TE
Gel-oprensning
Den vigtigste metode i moderne bioteknologi! PCR-metoden Den vigtigste metode i moderne bioteknologi!
PCR historie 1971: Kleppe et al 1976: Taq polymerase 1983: Kary Mullis A method using an enzymatic assay to replicate a short DNA template with primers in vitro. 1976: Taq polymerase DNA polymerase fra Thermus aquaticus. 1983: Kary Mullis Opfandt PCR metoden baseret på Taq-polymerase 1993: Kary Mullis fik Nobel prisen
PCR
PCR-basics Template DNA Primere Polymerase Buffer dNTP Mg2+ K+ DMSO Optimering: Annealing temperatur Primersekvens [Mg2+] Hot start Tuch-down start
PCR-applikationer Selektiv amplificering fra gDNA Prober DNA-kloning DNA-fingerprinting Amplificering og kvantifikation Små DNA koncentrationer (PaleoPCR) Genekspression Diagnose Genetiske varianter Bakterielle og virus inektioner
Mange forskellige typer PCR Allele-specific PCR single-nucleotide polymorphisms (SNPs) Allel-størrelse (STR- FBI) Assembly PCR Samling af lange overlappende stykker DNA Asymmetric PCR DNA sekventering Quantitative PCR, Q-PCR, Real time-PCR Bestemmelse af udgangskoncentrationer af DNA, cDNA eller RNA RT-PCR (Reverse Transcription PCR) reverse transcriptase omdannelse af RNA til cDNA efterfulgt af PCR Mutagenesis PCR Indføring af mutationer med PCR Degenered PCR Nested PCR