Institut for Medicinsk Mikrobiologi og Immunologi BAKTERIEGENETIK Knud Poulsen Institut for Medicinsk Mikrobiologi og Immunologi kp@microbiology.au.dk
GENERELT Et kromosom (haploid) Cirkulært (få undtagelser) Ca. 3.000.000 nukleotider (1 mm) Al information til hvad bakterien kan lave af enzymer, hvordan den ser ud, hvordan den kan give sygdom osv. ligger gemt i rækkefølgen af baserne A T G og C i genomet
Et typisk bakteriegen DNA transkription RNA translation polypeptid Promoter (binder RNA polymerasen) DNA transkription RNA translation polypeptid aktivt protein
I bakterier er transkription og translation ikke adskilt (ingen membranstrukturer inde i cellen) RNA polymerase DNA polypeptid tRNA RNA
Genomsekvensen af Haemophilus influenzae (1995) 1.830.137 nukleotider 1743 gener for proteiner 736 gener med ukendt funktion I dag kendes genomsekvenserne for alle væsentlige humant- pathogene bakterier
Sanger’s dideoxy metode ”next-generation” sekventering DNA sekventering Sanger’s dideoxy metode ”next-generation” sekventering
Sanger’s dideoxy metode DNAet opformeres (klones/PCR) 2. Sekvensreaktion med dNTP, mærkede ddNTP, DNA polymerase 3. Gelelektroforese der separer med +/- 1 base
Roche 454 DNA sekventering Der kan læses ca. 500 baser i hver sekvens Der kan læses op til 1.000.000 sekvenser per kørsel
Emulsion Based Clonal Amplification(emPCR) 454 Emulsion Based Clonal Amplification(emPCR) Mix PCR Library & capture beads (limited dilution, excess of capture beads) “Break micro-reactors” Isolate DNA containing beads Create “Water-in-oil” emulsion + PCR Reagents + Emulsion Oil Perform emulsion PCR Adapter PCR library DNA products A B Micro-reactors Generation of millions of clonally amplified sequencing templates on each bead From: Roche 454 James Grabeau 2007 (www.lsbi.mafes.msstate.edu/Roche%20454%20James%20Grabau%202007.ppt )
Depositing DNA Beads into the PicoTiter™Plate 454 Depositing DNA Beads into the PicoTiter™Plate Load Enzyme Beads Load beads into PicoTiter™Plate Only one bead fits per well PicoTiter™Plate: Fiber-optic slide Size: 75 mm ✕ 75 mm depth: 55 μm, length: 44 μm 1.6-3.2 million wells per plate Capture beads in a sulution with bst DNA polymerase, nucleotides Enzyme beads: Luciferase and Bst ATP sulfurylase 44 μm Adapted from: Roche 454 James Grabeau 2007 (www.lsbi.mafes.msstate.edu/Roche%20454%20James%20Grabau%202007.ppt )
FLX Sequencing Reaction 454 FLX Sequencing Reaction Minus Apyrase til at fjerne overskydende Nucleotider og ATP https://www.roche-applied-science.com/servlet/RCConfigureUser?URL=StoreFramesetView&storeId=10357&catalogId=10356&langId=-1&countryId=jp
Reagent flow and image capture 454 Reagent flow and image capture Photons Generated are Captured by Camera Reagent Flow PicoTiterPlate Wells Sequencing By Synthesis Sequencing Image Created Bases are introduced separately to the PicoTiter Plate, images are captured after each flow (one base). Adapted from: Roche 454 James Grabeau 2007 (www.lsbi.mafes.msstate.edu/Roche%20454%20James%20Grabau%202007.ppt )
454 Sequencing: BaseCalling Count the photons generated for each “flow” Base call using signal thresholds Delivery of one nucleotide per flow ensures accurate base calling Linearity in signal to at least homopolymers of length eight (quote from company) Base call accuracy of approximately 99.4% Flow Order TACG Measures the presence or absence of each nucleotide at any given position KEY (TCAG) 1-mer 2-mer 3-mer 4-mer Første baser er I sekvnesen er: Key tag (TCAG) + evt. Barcode + template specifik primer Sekvens primeren binder til de første baser I adaptorsekvensen undtagen TCAG (Key Tag) Hvis der er fejl I Key tag + evt Barcode og template primer sorteres disse sekvenser væk. mange af fejlene ligger I få sekvenser Adapted from: Roche 454 James Grabeau 2007 (www.lsbi.mafes.msstate.edu/Roche%20454%20James%20Grabau%202007.ppt )
Bakterier kan ”føle” omgivelserne Er der aerobt/anaerobt ? Er der jern tilgængeligt ? Hvilke næringsstoffer er der ? Hvad er temperaturen ? Har jeg kontakt med en værtscelle ? Er jeg intracellulært ? Er jeg alene eller er vi mange? Ekspressionen af en lang række gener (produktionen af proteiner) reguleres meget specifikt efter hvad bakterien ”føler”
Regulering af laktose-operonen i E. coli
Regulering af tryptofan operonen i E. coli
Regulering af tryptofan operonen i E. coli Attenuator site Virker som transcriptions terminator på mRNA fordi strukturen får RNA polymerasen til at falde af
MUTATIONER SKABER NYE VERSIONER AF BAKTERIERNE (EVOLUTION) Nogle mutationer giver ændringer i proteiner og dermed ændringer i fænotypen, som kan gøre bakterien mere ”fit” eller mere patogen. Evolutionen hos bakterier er meget hurtigere end hos os (kort generationstid, at de er haploide gør at mutationerne slår fuldt igennem med det samme)
EVOLUTION Bakteriearter udvikler sig og der kan opstå særligt patogene (eks. H. influenzae, E. coli) eller resistente (eks. MRSA, Salmonella DT104) undergrupper
Forskellige bakteriearter har forskellig grad af overførsel af gener / rekombination mellem bakterierne Mutationer dominerer Rekombination dominerer
Populationsgenetik på bakterier formål: At undersøge om der er særligt patogene undergrupper af bakteriearten Hvis ja, så at finde ud af hvad der gør dem mere virulente og dermed bedre at forstå patogenesen ved sygdommen Det kan bruges til bedre behandling og bedre forebyggelse (vaccination, begrænse smittespredning). Begrænse spredning af antibiotika-resistens.
Populationsgenetik på bakterier metoden: 1. Indsamle bakterie-isolater a. tidsmæssigt spredt b. geografisk spredt c. fra både infektioner og fra raske bærere 2. Genotype bakterie-isolaterne (f.eks. sekventere 7 ”husholdningsgener”) 3. Lave et stamtræ ud fra sekvenserne (computerprogram) 4. Relatere undergrupper af populationen til sygdom (er nogle undergrupper mere virulente end andre??)
Eksempel: Haemophilus influenzae serotype b De invasive isolater (meningitis/sepsis) ligger i clade 3 = Serotype b Hib vaccinen består af serotype b kapselen Konjugeret til et protein Vaccinen beskytter mod invasive H. influenzae infektioner
SEROTYPNING Preparation af f.eks. polysakkarid Antigen/antistof isolat 1 Preparation af f.eks. polysakkarid Antigen/antistof reaktion ??? Reaktion = Samme serotype Isolat 2 Isolat 3 Isolat 4
Streptococcus agalactiae (gruppe B streptokokker) Neigbor joining tree based on multi locus enzyme electrophoresis, biochemical characteristics, and sequences of fragments of the infB and sodA genes Host tropism correlates with clustering of the strains
Global fylogeni af Helicobacter pylori
Hvad definerer en bakterieart? Bakterierne har et fælles ensartet ”core” genom De har et basalt ensartet stofskifte og husholdningsenzymerne er meget ens i sekvens Den variable ”undværlige” del af genomet kan være meget forskellig mellem bakterierne Dette kan give forskelle i virulensegenskaber
Overførsel af DNA mellem bakterier
TRANSFORMATION Fremmed ”nøgent” DNA optages af bakterien Dette ”nye” DNA kan evt. integreres ind i genomet ved homolog rekombination og derved erstatte det ”gamle” DNA. Derved kan variation i et gen overføres fra en bakterie til en anden.
Konjugation Sexpilus Plasmid 34
Bacillus subtilis
Bacillus subtilis Staphylococcus aureus Escherichia coli Staphylococcus aureus
KONJUGATION Der er fysisk kontakt mellem de to bakterier og DNA fra den ene overføres direkte til den anden. Evnen til at overføre DNA ved konjugation bestemmes af et batteri af gener, der tilsammen gør at det er en ”han” bakterie.
BAKTERIOFAGER Virus hos bakterier Kan nogle gange sætte sig inde i bakteriens genom og nedarves som andre gener. Dette kaldes en profag og bakterien kaldes lysogen. En række toxiner laves af fager og det er kun de lysogene stammer af bakterien, der kan forårsage sygdommen.
Bakteriofag lambda EM billede E. coli inficeret med λ-fager
TRANSDUKTION Bakteriofager (eller rettere proteinkapselen fra disse) kan være bærere af DNA fra en bakterie til en anden, og dette fremmede DNA kan evt. indsættes i genomet ved homolog rekombination Variation i et gen kan således overføres fra en bakterie til en anden
mobile/transposable genetiske elementer Segmenter af DNA, der kan flytte fra en position til en anden i genomet (de indeholder gener, der koder for enzymer som integrase, transposase, rekombinase osv. der ”klipper” segmentet ud og integrerer det ind et nyt sted) insertionssekvenser,integrons,transposons, konjugative transposons Er ofte med til at overføre patogenese-øer fra en art til en anden (flankerer øen) VIGTIGT: de bærer meget ofte gener der koder for resistens mod antibiotika
Conjugative transposons
Science december 2003
Sekvenser af ribosomal RNA gener (især 16S rRNA) bruges til identifikation af bakterier og til diversitets studier
16S rRNA 16S rRNA molekylet består af: Konserverede områder der er ens i alle bakterier Variable områder der er karakteristiske for den enkelte art Hypervariable områder der er karakteristiske for det enkelte isolat Derfor kan der designes primere til PCR der dækker alle arter og sekvenserne viser hvilken art det er.
Diversitetsstudier baseret på 16S rRNA sekvenser En stor del af bakterierne i vores normalflora kan ikke dyrkes på de sædvanlige substrater. Forekomsten af disse ikke-dyrkbare bakterier kan analyseres ved DNA baserede metoder som f.eks. PCR amplifikation og sekventering af 16S rRNA gener og metagenom analyser
You are not alone ! Tarmens microbielle flora: biomasse ca. 1,5 kg no. af arter cirka 1000 Antal celler: bakterier 1014 dine egne celler 1013 Antal gener: bakterielle 3x106 dit eget genom 2x104
Bakterierne i tarmen har betydning for vores sundhed
”DNA fingerprinting” af bakterier Bruges til epidemiologiske studier f.eks. til at opspore smittekilder f.eks. Salmonella enterica, Staphylococcus aureus, Mycobacterium tuberculosis Spredning af antibiotika-resistente kloner Metode: Bakteriens genom kløves med et restriktionsenzym DNA fragmenterne separeres ved gel-elektroforese (PFGE) DNA fragmenterne visualiseres ved farvning med EtBr og UV-lys
”DNA fingerprinting” til at type bakterier Streptococcus agalactiae kløvet med SmaI