Resistensundersøgelse Klinisk Mikrobiologisk afdeling Regionshospitalet Herning Bioanalytikerunderviser Lilian Christensen Resistensundersøgelse – overordnede principper Agardiffusion Etest Kvalitetssikring Antibiotika

MIC Mindste inhiberende concentrations test 16 8 4 2 1 16 8 4 2 1 Resistensundersøgelser er baseret på bestemmelse af MIC som betyder den mindste inhiberende eller hæmmende concentration. Den oprindelige metode var en bouillonfortyndingstest. Til boillonen er tilsat antibiotika i to foldsfortyndinger som vist på billedet. Nederst er der vækst i alle rør. Dvs bakterien er resistent. Øverst er der tiltagende vækst fra venstre mod højre med aftagende antibiotikakoncentration. Mindste hæmmende koncentration er altså 8. Bouillonfortyndingsmetoden betragtes stadig som guldstandard når det gælder resistensundersøgelser. Den udføres da i mikrotiterbakker og turbiditeten i rørene aflæses fotometrisk. Den anvendes mest i projektøjemed. Er der i praksis brug for MICbestemmelse udføres i stedet en Etest som er en moderne udgave af bouillonfortynding. Der findes i dag også apparatur til bestemmelse af MIC fx Vitek

Dannelse af hæmningszone Disk Komplet hæmning Forsinket vækst Partiel hæmning Stimuleret vækst Agar medie Bakterier Agardiffusion er diffusion af antibiotika fra en antibiotikadisk eller –tablet ud i agaren. Hvis bakterien er følsom for antibiotikaet vil der opstå en hæmningszone på den tilsåede agarplade som følge af at antibiotika diffunderer ud i mediet og hæmmer bakteriensvækst. Antibiotikakoncentrationen vil aftage med afstanden fra antibiotikadisken eller tabletten så i en hvis afstand fra antibiotikadepotet vil bakterien kunne vokse frem.

MIC >< agardiffusion Mindste inhiberende concentrations test Agardiffusions test 16 8 4 2 1 På dette billede ses øverst hvorledes en følsom bakterie hvor væksten hæmmes ved en bestemt koncentration af antibiotika i rørene også vil vokse frem med en hæmningszone ved agardiffusion. Modsat vil en resistent bakterie vokse i alle rørene og ved agardiffusion dannes ingen hæmningszone. I realiteten vi zonen dog ofte blot være mindre ved resistens. Det er vigtigt at vide hvad MIC skal være for at bakterien kan kaldes følsom og hvor stor zonediameteren skal være.

Bakteriepopulation Populationsstudier udført af SRGA   Populationsstudier udført af SRGA Bakterieantal som funktion af MIC S N   I Bl.a. SRGA som er svensk reference gruppe for antibiotika har udført populationsstudier af en lang række forskellige bakterier over for en lang række af forskelligt antibiotika. Bakteriestammerne grupperes i forhold til deres MIC som antallet N som funktion af MIC. Herved er det muligt at lægge breakpoints eller brydningspunkter ind for hvornår bakterien er følsom eller resistent. På figuren fremgår det hvordan de er lagt for det sorte kurveforløb hvor bakterierne har fordelt sig optimalt med en tydelig afstand mellem de følsomme og de resistente stammer. Der er altså en stor gruppe af bakterier med lav MIC som betragtes som følsomme markeret med S. Så er der stort set ingen inden den næste mindre pukkel til højre hvor de resistente stammer befinder sig markeret med R. De få stammer der har grupperet sig mellem puklerne betegnes med I svarende til intermediære eller nedsat følsomme. Det er dog ikke altid det er så enkelt at lægge breakpoints, hvilket det grønne og det blå kurveforløb illustrerer. R   MIC  

Regressionsanalyse Når breakpoints er fundet ved MIC-bestemmelse undersøges bakterierne for det samme antibiotika med agardiffusion me disk eller tablet. Zonestørrelserne afbildes for hver bakteriestamme som funktion af MIC. Vha. regressionsanalyse lægges den bedste rette linie gennem punkterne. Jp tættere R2 er på 1 Jo bedre ligger punkterne på linien og jo mere troværdig er undersøgelsen.

Regressionsanalyse Når MIC breakpoints kendes – her fx som 8 svarende til resistent og 4 svarende til følsom kan zone breakpoints findes. På illustrationen her vil det sige at en zonestørrrelse på 22 mm eller derunder svarer til resistent og en zonestørrelse på 33 eller derover svarer til følsom.

Gensekventering Anvendes til problembakterier MecA genet hos MRSA Van A, B og C gener hos enterokokker Andre bakterier i forskningsøjemed til detektion af resistensmekanismer PCR og efterfølgende gensekventering kan anvendes til at detektere gener der koder for resistens og som giver særlige problemer. Fx MecA genet som koder for methicillin resistens hos stafylococcus aureus og Van A , B og C gener som koder for vancomycinresistens hos enterokokker. På trods af at metoden er dyr og omstændelig er det den sikreste metode som med tiden vil spille en mere og mere fremtrædende rolle.

Standardmetoder KMA Herning Agardiffusion efter svensk standard Evt. suppleres med Etests Evt suppleres med specielle undersøgelser ved særlige resistensproblemer. ( MRSA, ESBL ) For bekræftelse af specielt resistente bakterier sendes stammen til SSI På KMA i Herning udfører vi agardiffusion efter svensk standard. I tilfælde hvor bestemmelse af MIC er påkrævet udføres Etest. Ved særlige resistensproblemer udføres specielle undersøgelser. Det kan fx være E coli der er resistent over en gruppe af antibiotika som benævnes cefalosporiner. Bakterien mistænkes da for at producere et enzym benævnt ESBL som gør dem særligt resistente. Eller Det kan være methicillinresistente Stafylococcus aureus kaldet MRSA. Desuden bliver Fx MRSA altid sendt videre til Statens Serum Institut til konfirmering og overvågning.

Ekstra viden www.srga.org http://www.rosco.dk/Default.aspx?ID=429 www.medicin.dk På SRGA’s hjemmeside findes deres metodehåndbog og breakpoints. Derudover er der mange nyttige oplysninger om antibiotika og resistensmekanismer. På Roscos hjemmeside ligger users guide til neo-sensitabs tilgængelig med metodehåndbog og breakpoints ved brug af firnmaets tabletter. På medicin.dk kan alle antibiotika slås op under præparatnavne eller indholdsstoffer. Her kan findes strukturformler, oplusninger om farmakokinetik og virkemåde.