DNA 序列测定 末端终止法 -- 待测单链 DNA 模板 引物 四种 dNTP( 其中一种用 32 P/ 35 S 标记 ) 终止剂 (ddNTP) DNA 聚合酶 Sanger 发明：两次获得诺贝尔奖 分别得到 ddA ddT ddG ddC 结尾的片段
测序过程 : –1. 模板与引物杂交 –2. 引物的延长和合成阻断 * 四个试管分别加入 DNA 聚合酶 dNTP 标记底物 * 终止剂不同 ddA ddG ddC ddT * 四个试管中所有产物是一系列长度只差一个核苷酸 的聚合链 –3. 电泳 ACGT 次序 高压电泳 –4. 放射自显影得到直读图象
第十章 核酸分子杂交技术 概念：具有互补序列的两条核酸单链在 一定条件下，按碱基配对原则形成双链 的过程。 探针 待测核酸 杂交分子 核酸分子杂交的基本原理 核酸分子杂交的基本方法 探针的标记
核酸分子杂交的基本原理 DNA 变性 – 方法 * 热变性： 90~100 ℃ * 酸碱变性：常采用碱变性 * 化学试剂变性：尿素、甲酰胺、甲醛等 – 特点：粘度增加、密度增加、增色效应、溶 解温度 (melting temperature,Tm) DNA 复性或杂交 (hybridization) –DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA 等
影响杂交的因素 核酸分子的浓度和长度 – 浓度大，复性快；分子量大，复性慢 温度 离子强度 杂交液中的甲酰胺 核酸分子的复杂性 非特异性杂交反应 – 预杂交：封闭非特异性杂交位点，用鲑鱼精子 DNA
分子杂交的基本方法 Southern 印迹法 Northern 印迹法 斑点印迹杂交 原位杂交 Western 印迹法 液相杂交
bp — 1534 — 994 — 695 — 515 — 377 — 237 A B C M
Southern 印迹杂交 1975 年，英国 Southern 创建 DNA/DNA 杂交，即将 DNA 电泳、转印到 固相支持物上，用探针进行检测的方法。
Southern 杂交 (Southern bloting) 的主要步骤 待测 DNA 样品的制备、酶切 待测 DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 凝胶中 DNA 的变性：碱变性 Southern 转膜： – 硝酸纤维素 (NC) 膜、尼龙膜 – 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 探针的制备 Southern 杂交 杂交结果的检测
Northern 印迹杂交 (Northern bloting) 检测 RNA （主要是 mRNA ）的方法 与 Southern 杂交的不同 – 靶核酸： RNA –RNA 电泳 – 转膜：不需变性
斑点印迹杂交 (dot bloting) 将 RNA 或 DNA 变性后直接点样于 NC 膜或 尼龙膜上 优点：简单、快速、可同时检测多个样 品
原位杂交 (in situ hybridization) 将标记的核酸探针与细胞或组织中的核 酸进行杂交，称为原位杂交。 特点 – 能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究 – 不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低 的靶序列灵敏度高 – 能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态
核酸原位杂交的基本步骤 细胞或组织的固定：载玻片 组织细胞杂交前的预处理 – 用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质 探针的选择和标记 杂交 杂交结果检测
Western 杂交印迹法 (Western bloting) 检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋 白质转移到固相载体上，用特异的抗血 清对蛋白质进行鉴定及定量的方法 主要步骤： – 蛋白质样品的制备 –SDS- 聚丙烯酰胺凝胶 (PAGE) 电泳 – 蛋白质的电转移： NC 膜 – 靶蛋白的免疫学检测 * 靶蛋白于第一抗体（一抗）反应 * 与标记的第二抗体（酶标二抗）反应 * 显色反应：酶促反应
液相杂交 核酸分子与核酸探针存在于杂交液中 RNA 酶保护分析法 核酸酶 S1 保护分析法
探针的标记 探针的种类 –cDNA 探针、基因组 DNA 探针、寡核苷酸探针、 RNA 探针 标记物 – 核素标记物（同位素标记）： 32 P 、 35 S 、 3 H 等 – 非核素标记物（非同位素标记）：生物素、地 高辛、荧光素等
探针标记方法 – 缺口平移法 (nick translation) – 随机引物法 (random primer) ：六核苷酸残 基的引物 –PCR 标记法 – 末端标记法 探针的纯化