Efteruddannelse i Bioteknologi Kursus A DNA sekventering

Kursus indhold

Det humane genom projekt Den spæde start i 1983 HUGO 1988 Projektet påbegyndes i 1990 Skitsen færdig i 2003 Endeligt færdig 2006 Celera beskytte gensekvenser Clinton nej til patent af gener Celera vandt opløbet, men valgte at publicere sammen med international konsortium Celera lovede at publicere sine resultater i åbne databaser - dette er dog ikke sket Internationalt konsortium (1$/bp) Firmaet Celera (1996)

Craig Ventor Craig ventor 5 personers DNA CV en af dem International konsortium Flere personers DNA fra blod og sæd Uofficielt er det hovedsageligt DNA fra én mandlig sæddonor fra New York Craig Ventor

Watson og Crick Da strukturen af DNA blev bestemt af Watson og Crick i 1953 tog det for alvor fart med forståelsen af DNAs betydning og funktion

DNA strukturen DNA er en syre DNA består af de fire baser A, T, G og C, samt fosfat og ribose (sukker) A og T samt G og C findes altid i lige store mængder Let tilgængelig kode Selvkopiering (replikation) Stabilt molekyle Rosalind Franklin: Helix (spiral) struktur

Hvad er da resultatet ca. 6 milliard baser 20.000 – 25.000 gener ! (kun 1/3 af det forventede) Kun 2% af genomet er gener, resten er af ukendt funktion, i hvert fald 50% er ”junk” Vi kender kun funktionen af ca. 50% af de fundne gener Kromosom 1 har højest antal af gener – 2988 stk Y-kromosomet har kun 84 gener men kun 23 proteiner SRY gen trigger testis-dannelse Y 50 Mbp X 153 Mbp

Ikke blot humane genomer Mange andre genomer er sekventeret i dag : Mus Rotte Zebrafisk Bananflue Malariemyg Malarieparasitten Hvede Byg Havre Ris Arabidopsis (gåsemad) Gær Rødalge 640 (+ 392) Eubakterier 51 (+ 5) Archaebakterier 23 (+ 422) Eukaryoter 2598 vira 1465 organeller 1229 plasmider >200 milliarder baser i databasen

Mus og mænd… Store dele af vores DNA kan genfindes i musens genom. 70-90% (85%) lighed Menneskeaber 98% Mennesker 99,9%

Der er langt igen…

Hvordan afkodes sekvenserne? DNA sekventering Sekventiel sekventering Shot-gun sekventering

Sangers dideoxy-metode Fred Sanger udviklede enzymatiske dideoxy DNA-sekventerings-metode i 1977. Det er stadig samme metode, der bruges.

Dideoxynukleotider

Fire forskellige stopklodser

DNA sekvens, der skal analyseres fire separate reaktioner

Elektroforese af produkterne Denne sekvens er komplementær til den analyserede DNA streng

Autoradiogram og håndaflæsning Aflæsning af DNA-sekvenser ved hjælp af autoradiogrammer af 32P-ATP-mærkede DNA-fragmenter En meget langsommelig proces!

Kapillærelektroforese Tynde glaskapillærer med lineært poly-acrylamid som ”gel” Op til 96 parallelle kapillærer 300-800 baser pr kapillær pr elektroforese

Automatisk detektering af fluorescerende sekvensprodukter

Sekvensfabrik

Genom-sekventering

Procestid: sammenligning

3.5 Mkr device

PicoTitrePlate device

DNA library preparation

em-PCR

Plate prep og sequencing-by-synthesis

?

Databehandling

Whole genome mapping

De Novo assembly

De Novo assembly

Fremtidens sekvensmetode? Nanopore sequencing

Teknologisk udvikling År humane gener lokaliseret til en given position på et kromosom Antal år det ville tage at sekventere det humane genom 1967 ingen Det er endnu ikke muligt at sekventere DNA 1977 3 gener lokaliseret  4,000,000 år for at færdigøre ved 1977 hastighed 1987 12 gener lokaliseret  1000 år for at færdigøre ved 1987 hastighed 1997 30.000 gener lokaliseret  50 år for at færdigøre ved 1997 hastighed 2003 (2006) 30.000- 35.000 gener lokaliseret Genomet er færdigsekventeret

Craig Venter Celera The Institute for Genomic Research J. Craig Venter Institute Synthetic Genomics Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition Venters egen DNA sekventeret (2007) 6 milliarder baser!

Chip-teknologi

Hydrogenbindinger analyserer Kun prøver med rette sekvens vil hydrogen-binde til DNA-strengene på chippen. Bundne prøver lyser (fluorescerer) og kan derfor detekteres

10.000 - 100.000 gener ad gangen

Gene-Chip fra Affymetrix På kun 1,5 cm2 kan der analyseres for 10.000 gener Helbredscheck Sygdomscheck Prognose analyse

Menneskets udbredelse Y-kromosom viderebringes fra far til søn Mt-kromosom viderebringes fra mor til barn Ingen af disse kromosomer rekombinerer med med hinanden eller andre kromosomer Hvor finder vi Adam og Eva?

Menneskets udbredelse - mitochondriel DNA

Menneskets udbredelse - Y-kromosomalt DNA

Hvem ejer generne? Mennesket kan ikke patenteres! men dele af mennesket, herunder generne kan godt!!! Idag er en stor del af de kendte menneskelige gener patenteret, mange er dækket af flere patenter. Flest patenter i USA Myriad Genetics Brystcancer generne BRCA1 og BRCA2 Patent på al tænkelig forskning og alle tænkelige diagnostiske metoder Alle analyser skal foregå i USA USA - liberal patentkultur EU - omstødt patent på BRCA1 Canada - Statsfinancieret alternativ metode Australien - Genetic Technologies - patent på forskning

Er du patenteret?

Gennemgang af forsøgsvejledning Se i mappen