Protein Science A - Basic Lab Dias September GST-FYVE oprensning Kasper Kistrup, Niels Højsgaard og Mads Topp Nano-Science Center
Protein Science A - Basic Lab Dias September Oprensning af GST-FYVE Indsætning af gen i plasmid vektor Indsæt vektor i værtscelle (Transfektion) Lad populationen gro (inkubering v. 37ºC) Udtrykning af vores gen (Inducering v. IPTG) Selektion Høst af celler / Sonikering Affinitets kromatografi
Protein Science A - Basic Lab Dias September DNA Kloning
Protein Science A - Basic Lab Dias September Høst og oprensning Centrifugering og dekantering af supernatant Pellet af E.coli tilbage Sonikering Cellelysis Centrifugering Store celledele (Lysozyme, membraner etc) bundfældes (Gem prøve, P4) Supernatant filtreres i et Millipore filter (Store proteiner etc) (Gem prøve, P3)
Protein Science A - Basic Lab Dias September Affinitets kromatografi Protein prøve i søjle Eluering af uønskede proteiner (Gem prøve, P5) Vask med PBS for at fjerne uønskede proteiner (Gem prøve, P6) 10x1mL eluerings fraktioner Fraktion 2 og 3 udtages (P8 og P9) Regenerer søjlen
Protein Science A - Basic Lab Dias September Indhold af SDS-brønde LMW (Markør) P1 – E.coli P2 – E.coli efter 4 timers inkubation P3 – Supernatant efter sonikering og centrifugering (Spild) P4 – Bundfald efter sonikering og centrifugering P5 - Eluering af uønskede proteiner P6 - Vask med PBS for at fjerne uønskede ting P8 – Eluent 2 fra søjlen P9 – Eluent 3 fra søjlen
Protein Science A - Basic Lab Dias September Resultater GST-FYVE ved ~40-42 kDa markøren (Fra SDS-gel) Fra MALDI-TOF: GST-FYVE vejer 41 kDa