Bruce Madsen Industrifarmaceutforeningen 25. januar 2007 De nye harmoniserede testmetoder: “Microbial Limit Test”, 2.6.12 og “Test for Specified Microorganisms”, 2.6.13., Ph. Eur. 5. ed. Bruce Madsen Industrifarmaceutforeningen 25. januar 2007

Baggrund 1998: Arbejdsgruppe (Ph. Eur.) sammenligner metoder i Ph. Eur, USP og JP. 1999: Beslutning om harmonisering af bl.a. de mikrobiologiske kapitler i Ph. Eur., USP og JP 2001: Harmoniseret forslag publiseres (Pharmeuropa 13.1) 2003: Harmoniseret forslag publiseres (Pharmeuropa 15.3) 2005: Harmoniseret forslag vedtaget 2006: Harmoniseret tekst publiseret (Ph. Eur. 5.ed., Suppl. 5.6)

International harmonisering Hvor svært kan det være… Kultur, sprog og tradition Indflydelse på eksisterende produkter og producenter Ekstra-arbejde for producenter Lokale produkter og specialiteter Praksis kontra videnskab Detalje kontra flexibilitet Den bedste metode ? Lokale interessegrupper og brugere Harmonisering er mange gensidige kompromiser !

Kapitel 2.6.12 ”Microbiological examination of non-sterile products: Microbial Enumeration Tests”

Kapitel 2.6.12 og 2.6.13 Harmoniseret metode: Metode B Nye tekst Ph. Eur.: Metode A Nuværende tekst

Nye – harmoniserede - tekst Generelle forskelle: Alternative mikrobiologiske metoder kan anvendes. Anvendelse af inaktivatorer eller overfladeaktive stoffer skal ”valideres” ”validate” erstattet af ”suitability” Valg af metode afhænger af produkt og den fastsatte kim-grænse USP: Test ved membranfiltrering inkluderet

Growth Promotion Test 4.2 Harmoniseret metode: Testorganismer: Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Bacillus subtilis Candida albicans Aspergillus niger Suspensioner skal anvendes indenfor 2 timer eller 24 timer hvis opbevaret ved 2-8° C. Ph. Eur.: Testorganismer: Staphylococcus aureus E. coli Bacillus subtilis Candida albicans Aspergillus niger

Growth Promotion Test 4.4 Harmoniseret metode: Ph. Eur.: Test hver batch medium Bakterier: ≤ 3 dage Svampe: ≤ 5 dage Krav: Forskel mellem ny og gammel batch medium ≤ faktor 2. Ph. Eur.: Krav: Forskel mellem ny og gammel batch medium ≤ faktor 5.

Suitability of the Counting Method 4.5 Harmoniseret metode: Krav: Forskel i recovery i forhold til kontrol ≤ faktor 2. Modifikation af test ved 1) øge volumen 2) neutralisering 3) membranfiltrering 4) kombination af 1) - 3) Inaktiveringsmidler Tabel 2.6.12-3. Ph. Eur.: Krav: Forskel i recovery i forhold til kontrol ≤ faktor 5.

Testing of Product 5 Harmoniseret metode: Ph. Eur.: TSA inkuberes i 3-5 dage SAB inkuberes i 5-7 dage TAMC: Antal kolonier (bakterier, gær og skimmel) på TSA. TYMC: Antal kolonier (bakterier, gær og skimmel) på SAB. Ph. Eur.: TSA og SAB inkuberes i 5 dage (med mindre kortere tid er valideret) TSA: Kimtal, bakterier SAB: kimtal, svampe Total kimtal: TSA + SAB (ens kolonier tælles kun 1 gang)

Testing of Product 5.3 Harmoniseret metode: Ph. Eur.: Resultater: 101 : ≤ 20 CFU 102 : ≤ 200 CFU 103 : ≤ 2000 CFU - and so forth Ph. Eur.: Resultater: 102 : ≤ 5 x 102 CFU 103 : ≤ 5 x 103 CFU - and so forth

Kapitel 2.6.13 ”Microbiological examination of non-sterile products: Test for specified micro-organisms”

Nye – harmoniserede - tekst Generelle ændringer: Større klarhed Beskrivelse af dyrkning af testorganismer og udførelse af Growth Promotion Test Beskrivelse af testorganismer til GPT og inhibitoriske egenskaber (positiv og negativ kontrol) Beskrivelse af validering (”suitability”) af metoder Harmonisering af inkubation Test for Candida albicans tilføjet Alternative mikrobiologiske metoder kan anvendes R2A-agar ikke omtalt

Introduction 1 Harmoniseret metode: Anvendelse: Specifikationsanalyse Fælles reference-metoder Ph. Eur.:

Growth Promotion Test 3 Harmoniseret metode: Testorganismer: Ph. Eur.: Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa E. coli Salmonella typhimurium/ Salmonella abony Candida albicans Clostridium sporogenes Suspensioner skal anvendes indenfor 2 timer eller 24 timer hvis opbevaret ved 2-8° C. Ph. Eur.: Testorganismer: Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa E. coli Salmonella typhimurium/ Salmonella abony Clostridium sporogens/ Clostridium perfringens

Growth Promotion Test 3 Harmoniseret metode: Ph. Eur.: Seed lot culture system Teststammer dyrkes ved 30-35° C, 18-24 timer (bakterier), 20-25° C, 2-3 dage (Candida) Suspensioner skal anvendes indenfor 2 timer eller 24 timer hvis opbevaret ved 2-8° C. Ph. Eur.: Teststammer dyrkes ved 30-35° C, 18-24 timer

Growth Promotion Test 3 Ph. Eur.: Harmoniseret metode: Anvend testorganismer enkeltvis Aflæs efter korteste inkubationstid. Ved inhiberende medier aflæs efter længste inkubationstid. Sammenlign med tidligere anvendt og godkendt batch Hver batch “ready-prepared and dehydrated” medium testes Ph. Eur.: Anvend blanding af test-organismer Hver batch ”dehydrated” medium testes.

Test for Galde-tolerante Gram-negative bakterier Harmoniseret metode: ”Test for Galde-tolerante gram-negative bakterier” Præ-inkubation i TSB, 20-25° C, 2-5 timer Mossel-broth, 30-35° C, 24-48 timer RVG-agar (glucose), 30-35° C, 18-24 timer Vækst er positivt resultat Ph. Eur.: ”Test for Enterobacteria og andre gram-negative bakterier” Præ-inkubation i Lactose-boullion, 35-37° C, 2-5 timer Mossel-broth, 35-37° C, 18-48 timer Medium F (lactose, glucose), 35-37° C, 18-24 timer Typiske kolonier er positivt resultat

Kvantitativ test opnås ved regulering Test for E.coli 4.2 Harmoniseret metode: Præ-inkubation i TSB, 30-35° C, 18-24 timer MacConkey-broth, 42-44° C, 24-48 timer MacConkey-agar, 30-35° C, 18-72 timer Vækst regnes for E.coli. Vækst bekræftes Ph. Eur.: Præ-inkubation i TSB, 35-37° C, 18-24 timer MacConkey-broth, 41-43° C, 18-48 timer MacConkey-agar, 35-37° C, 18-72 timer Suspekte kolonier undersøges for E.coli Kvantitativ test opnås ved regulering af prøvestørrelse (0,1g, 0,01g)

Test for Salmonella 4.3 Harmoniseret metode: Ph. Eur.: Præ-inkubation i TSB, 30-35° C, 18-24 timer Rappaport Vassiliadis-broth, 30-35° C, 18-24 timer Xylose-Lysin-agar, 30-35° C, 18-48 timer Typiske kolonier regnes for Salmonella. Vækst bekræftes. Ph. Eur.: Præ-inkubation i TSB, 35-37° C, 18-24 timer Tetrathionate-broth, 41-43° C, 18-24 timer Deoxycholate-agar/Xylose-Lysin-agar/Brilliant grøn-agar (min. 2), 35-37° C, 18-72 timer Suspekte kolonier undersøges i TSJ-agar Positivt resultat kan bekræftes ved biokemiske tests.

Test for Pseudomonas aeruginosa 4.4 Harmoniseret metode: Præ-inkubation i TSB, 30-35° C, 18-24 timer Cetrimid-agar, 30-35° C, 18-24 timer Vækst regnes for Pseudomonas aeruginosa. Vækst bekræftes. Ph. Eur.: Præ-inkubation i TSB, 35-37° C, 18-24 timer Cetrimid-agar, 35-37° C, 18-72 timer Suspekte kolonier overføres til TSB, 41-43° C, 18-24 timer Vækst regnes for positivt resultat

Test for Staphylococcus aureus 4.5 Harmoniseret metode: Præ-inkubation i TSB, 30-35° C, 18-24 timer Mannitol Salt Agar, 30-35° C, 18-72 timer Suspekte kolonier undersøges og Staphylocuccus aureus bekræftes Ph. Eur.: Præ-inkubation i TSB, 35-37° C, 18-48 timer Baird-Parker Agar, 35-37° C, 18-72 timer Suspekte kolonier undersøges for Koagulase eller Deoxyribo-nuclease

Test for Clostridia 4.6 Ph. Eur.: Harmoniseret metode: Opformering i Reinforced Medium for Clostridia, 30-35° C, 48 timer Columbia Agar, 30-35° C, anaerobt, 48 timer Suspekte kolonier undersøges og bekræftes Ph. Eur.: Opformering i Reinforced Medium for Clostridia, 35-37° C, 48 timer Columbia Agar med Gentamycin, 35-37° C, 48 timer Vækst inokuleres på Columbia Agar uden Gentamycin, 35-37° C, 48 timer, aerobt og anaerobt Katalase test

Test for Candida albicans 4.7 Harmoniseret metode: Opformering i Sabouraud Dextrose Broth, 30-35° C, 3-5 dage Sabouraud Dextrose Agar, 30-35° C, 24-48 timer Suspekte kolonier undersøges og bekræftes Ph. Eur.:

R2A-agar Medium Ikke omtalt i harmoniseret tekst Monografier – Water for Injection, Water, purified og Water, highly purified ændres: R2A-agar-Medium inkluderes Growth Promotion Test inkluderes: Pseudomonas aeruginosa E. coli Bacillus subtilis

1. General notices Ændring vedrørende mikrobiogiske medier (Ph. Eur., suppl. 5.6): ”Culture media: The culture media described in the monographs and general chapters have found to be satisfactory for intended purpose. However, the components of media, particularly those of biological origin, are of variable quality, and it may be necessary for optimal performance to modulate the concentration of some ingredients, notably: - peptones and meat or yeast extracts, with respect to their nutritive properties; - buffering substances; - bile salts, bile extracts, deoxycholate, and colouring matter, depending on their selective properties; - antibiotics, with respect to their activity.

brm@novonordisk.com