תרגול מס' 3: קביעת הרכב ורצף של חומצות אמינו בפפטיד/חלבון

Præsentationer af emnet: "תרגול מס' 3: קביעת הרכב ורצף של חומצות אמינו בפפטיד/חלבון"— Præsentationens transcript:

1 תרגול מס' 3: קביעת הרכב ורצף של חומצות אמינו בפפטיד/חלבון
קביעת הרכב וכמות חומצות אמינו. קביעת קצה אמיני: שיטת אדמן או סנגר. קביעת קצה קרבוקסילי: קרבוקסיפפטידאזות. קביעת רצף בתוך הפפטיד: ריאקציות ביקוע שונות.

2 קביעת הרכב וכמות של חומצות אמינו
6M HCl 110°, 24h Ion Exchange chromatography Ninhydrin reaction קבלת כמות מולרית של כל ח.א. שבפוליפפטיד A B C D פוליפפטיד תערובת ח. אמינו הרכב פירוק הקשרים הפפטידיים והדיסולפידים הפרדת חומצות האמינו השונות כימות כל חומצה אמינית בנפרד

3 2. קביעת קצה אמיני: ראגנטים הניקשרים קוולנטית לאמין ראשוני.
א. ראגנט סאנגר (Sanger reagent) FDNB שיטה לקבוע את הקצה האמיני בלבד FDNB הידרוליזה חומצית DNB H3+N + FDNB DNB במהלך ההידרוליזה החומצית הפפטיד עובר דגרדציה לכל מרכיביו ולכן לא ניתן לסמן במחזוריות אלא רק פעם אחת . אם יש בחלבון תתי-יחידות עם חומצות אמינו שונות בקצה – נקבל אינפורמציה על כך.

4 ב. שיטת אדמן קביעת רצף פפטידים (Edman’s degradation)
ריאגנט אדמן ניקשר קוולנטית לקבוצות אמין ראשוניות. בחלבון הוא ייקשר בד"כ לקצה האמיני של השרשרת הפוליפפטידית. לאחר ההידרוליזה החומצית שאר החלבון נשאר שלם. שיטה זו טובה לריצוף עד 50 ח.א. הידרוליזה חומצית עדינה

5 חותכים ח. אמינו מהקצה הקרבוקסילי של הפפטיד.
.3 קביעת קצה קרבוקסילי: קרבוקסיפפטידאזות: חותכים ח. אמינו מהקצה הקרבוקסילי של הפפטיד. כאשר שמים אנזים לזמן קצר הוא יבצע רק ביקוע אחד וישחרר את החומצה האמינית האחרונה. קרבוקסיפפטידאז A : יוריד כל חומצה אמינית אחרונה למעט : Pro, Arg, Lys כלומר אם השתמשנו באנזים ולא קיבלנו תוצר ביקוע – אחת מהשלושה נמצאת בקצה הקרבוקסילי קרבוקסיפפטידאז B : יוריד כל חומצה אמינית אחרונה למעט : . Arg, Lys

6 4. קביעת רצף בתוך הפפטיד: שיטות לביקוע חלבונים לפפטידים באופן ספציפי – ביקוע אנזימטי טריפסין : חותך אחרי (בצד הקרבוקסילי של....) ליזין או ארגינין – חומצות אמינו טעונות חיובי כימוטריפסין : חותך אחרי (בצד הקרבוקסילי של....) טירוזין, טריפטופן ופנילאלנין – חומצות אמינו ארומטיות

7 4. קביעת רצף בתוך הפפטיד: שיטות לביקוע חלבונים לפפטידים באופן ספציפי – ביקוע כימי ציאנוגן ברומיד: חותך אחרי (בצד הקרבוקסילי של....) שיירי מתיונין קביעת רצף חלבונים – . ביקוע שרשרת החלבון לפפטידים קצרים. . ריצוף כל פפטיד בניפרד בשיטת אדמן. . עריכת החלבון לפי רצפים חופפים שזוהו.

8 נתון: המשקל המולקולרי של X בסביבות 650
שאלה מס' 21: נתון: המשקל המולקולרי של X בסביבות 650 מסקנה: הפפטיד מכיל כ-6 חומצות אמינו: נתון: הפפטיד מכיל כמויות מולריות שוות של אלאנין, חומצה אספרטית וטירוזין מסקנה: נצפה שיהיו בפפטיד שתי ח.א. מכל סוג.(2Ala,2Asp,2Tyr) נתון: בשיטת סנגר התקבל התוצר DNB-אלנין. מסקנה: החומצה האמינית הראשונה בפפטיד היא: Ala נתון: טיפול ממושך בפפטיד X בכימוטרפסין הביא ליצירת שני פפטידים A ו-B שני הפפטידים החדשים הכילו גם אלנין, חומצה אספרטית וטירוזין. מסקנה: טירוזין אחד נמצא בקצה הקרבוקסילי (אחרת היינו מקבלים שלושה מקטעים) וטירוזין נוסף נמצא באמצע כי קיבלנו 2 שלשות נתון: טפול ב- A בשיטת סנגר נתן DNB- אספרטית, וטיפול ב-B נתן DNB אלנין Ala, Asp, Tyr Ala, Asp, Tyr Tyr Asp Ala Tyr Ala Asp NH3+ COO-

9 Gly+Ala+2Cys+Arg+Glu+Ile+Thr+Phe+Val
שאלה מס' 23: בהידרוליזה חומצית של פפטיד התקבלו החומצות האמיניות הבאות: Gly+Ala+2Cys+Arg+Glu+Ile+Thr+Phe+Val בחיזור הפפטיד המקורי עם מרקפטואתנול ואלקילצית שיירי הציסטאין עם יודואציטט התקבלו 2 פפטידים קטנים יותר (A+B). הצע מבנה לפפטיד לפי הנתונים הבאים: :A פפטיד נתון: מכיל Ala, Gly, Cys, Glu, Arg, Ile (קרבוכסיפפטידז A מוריד כל ח"א אחרונה למעט : Pro, Arg, Lys ( נתון: קרבוכסיפפטידז A שחרר Ile מסקנה: Ile נמצאת בקצה הקרבוקסילי נתון: בטפול בריאגט EDMN התקבלו PTH-Gly מסקנה: Gly בקצה האמינו טרמינלי נתון: בטפול בטריפסין התקבלו 2 פפטידים, האחד הכיל Gly+Ala+Cys+Arg והשני הכיל Glu+Ile . מסקנות: 1) מיקום ה - Arg 2) מיקום ה - Glu נשאר לקבוע את מיקום Ala ו-Cys Cys Ala Arg Glu Ile Gly NH3+ COO- Cys Ala

10 פפטיד B: מכיל Thr+Val+Cys+Phe נתון: קרבוקסיפפטידאז A שיחרר Val
נתון: כימוטריפסין שחרר Val וטריפפטיד המכיל Cys, Thr, Phe מסקנה: Phe נמצאת לפני ה- Val נתון: בדגרדציית אדמן התקבל PTH-Thr מסקנה: Thrבקצה האמינו טרמינלי – Cys אחריה s NH3+ COO- Ile Gly Arg Glu Cys Ala NH3+ Thr Cys Phe Val COO-

11 מסקנה: סה"כ 9 חומצות אמינו בפפטיד
שאלה מס' 22: בהידרוליזה חלקית של חלבון התקבלו מספר פוליפפטידים. אחד מהם בודד. קבע את רצף החומצות האמיניות בפוליפפטיד זה מתוך הנתונים הבאים: א) נתון: בהידרוליזה חומצית ובסיסית מלאות התקבלו: Ala+Arg+2Ser+Lys+Phe+Met+Trp+Pro מסקנה: סה"כ 9 חומצות אמינו בפפטיד ב) נתון: בטיפול ב- FDNB ואח"כ הידרוליזה חומצית מלאה נגזרות ה- DNB שהתקבלו היו: DNB-Ala+ DNB-Lys מסקנה: מריאקצית סנגר לא קיבלנו תשובה סופית לגבי החומצה האמינו הראשונה. ח. אמינו ראשונה תהיה Ala או Lys. ג) נתון: קרבוכסיפפטידז A לא משחרר כל חומצה אמינית מהקצה -C מסקנה: קרבוקסיפפטידאז A אינו מוריד את חומצות האמינו Pro, Arg ו- Lys. מכיוון שהוא לא משחרר אף חומצה ניתן להסיק כי החומצה האחרונה בפוליפפטיד היא אחת מהשלושה ד) נתון: בטפול בציאנוגן ברומיד (CNBr) התקבלו שני פפטידים האחד הכיל SER+TRP+PRO והשני את כל החומצות האמיניות הנותרות. NH3+ Ala/Lys COO-

12 מסקנות: 1) ציאנוגן ברומיד מבקע רק אחרי Met
מסקנות: 1) ציאנוגן ברומיד מבקע רק אחרי Met. לפי ב' הפפטיד הקצר יותר שמכיל Pro, Trp ו- Ser לא יכול להיות בקצה האמינו טרמינלי של הפוליפפטיד ולכן יהיה בקצה הקרבוקסילי. ולכן Met תהיה החומצה הרביעית מהקצה הקרבוקסילי. 2) ומ-ג' ניתן לומר כי החומצה האחרונה היא Pro ה) נתון: בטיפול בכימוטרפסין התקבלו 3 פפטידים. האחד הכיל רק SER+PRO השני הכיל רק MET+TRP והשלישי הכיל PHE+LYS+SER+ARG+ALA. מסקנות: 1) כימוטריפסין מבקע רק אחרי ח. אמינו ארומטיות. הפפטיד שמכיל רק Ser ו- Pro חייב להיות בקצה הקרבוקסילי – ומכאן ש- Ser היא הח. האמינו שנייה מהסוף. 2) הפפטיד שמכיל Met ו- Trp מלמד אותנו על מיקומה של Trp כשלישית מהקצה הקרבוקסילי. 3) הפפטיד השלישי שהתקבל יכול ללמד אותנו על מיקומה של Phe הארומטית – חמישית מהקצה האמינו טרמינלי Ala+Arg+2Ser+Lys+Phe+Met+Trp+Pro NH3+ Ala/Lys Phe Met Trp Ser COO- Pro

13 ו) בטפול בטרפסין התקבלו 3 פפטידים
ו) בטפול בטרפסין התקבלו 3 פפטידים. האחד הכיל רק ALA+ARG, השני הכיל SER+LYS והשלישי הכיל PHE+TRP+MET+SER+PRO. מסקנות: 1) טריפסין מבקע רק אחרי Lys ו- Arg. אם Lys היתה החומצה הראשונה בפוליפפטיד, מטריפסין היינו מקבלים רק שני פפטידים, מכיוון שקיבלנו שלושה פפטידים אחרי ביקוע עם טריפסין – נוכל להסיק כי Ala היא החומצה הראשונה 2) מכיוון ש- Ala מתקבלת בפפטיד עם Arg, נסיק כי Arg היא החומצה השניה 3) על מנת שנקבל את הפפטיד השני Ser צריכה להיות החומצה השלישית ו- Lys הרביעית. Ala+Arg+2Ser+Lys+Phe+Met+Trp+Pro NH3+ Ala/Lys Arg Ser Lys Phe Met Trp Ser COO- Pro