Tre eukaryote RNA polymerse aktiviteter kan identificeres efter partiel oprensning.

Præsentationer af emnet: "Tre eukaryote RNA polymerse aktiviteter kan identificeres efter partiel oprensning."— Præsentationens transcript:

1 Tre eukaryote RNA polymerse aktiviteter kan identificeres efter partiel oprensning

2 RNA polymeraserne har forskellig lokalisering Nukleoplasma Nukleolær

3

4

5 RNA pol I, II, III viser forskellig sensitivitet til  -Amanitin

6 Pull-down eksperiment med ”tagged” RNA pol II subunit

7 Flere sububnits deles mellem RNA polI, II og III

8 Subunit sammensæt- ning af RNA polymerase II fra gær.

9

10 Figure 10.8 Største RNA pol II subunit forekommer i tre former IIo, IIa og IIb IIo fosforyleret version af IIa IIb mangler ”Carboxy terminal domain” (CTD) (Y-S-P-T-S-P-S) RNA pol IIO binder til promotoren RNA pol IIA elongerer

11 Opbygningen af Polymerase II promotorer.

12 Elementer i RNA pol II promotor TFIIB genkendelse Initiator Downstream promotor element

13 TATA løse promotorer: Housekeeping gener Homeotiske gener TATA holdige promotorer: Gener som er vævspecifikt udtrykte

14 Deletionsanalyse og S1 mapning viser funktionen af TATA boxen (fjernes TATA boxen bliver transkriptionen promiskøs, men initieringen bliver ikke mindre, fjernes DNA mellem TATA box og startsitet, rykkes dette bare tilsvarende)

15 Linker scanning mutagenese af herpes virus thymidin kinase identificerer sekvenser af betydning for transkriptionen Linker: Et syntetisk stykke dobbelstrenget DNA Ved succesivt at erstatte DNA i promotoren med en linker af samme længde ændres alle små sekvenser i promotoren

16

17 Primer extension analyse af linker scanning mutanter udtrykt i Xenopus oocytter viser at TATA boxen er essentiel L-29/-18 fjerner TATA boxen

18 Konsensus initiator sekvens, PyPyAN(T/A)PyPy TATA box, binder TBP som er del af TFIID Ofte fundne upstrøms sekvenser, GC box, CAT box GC boxen og CAT boxen øger transkriptionsinitieringen GC boxen bindes af transkriptionsfaktoren Sp1 CAT boxen bindes af CTF (CCAAT bindende transkriptions faktor)

19 To elementer i RNA pol I promotorer Linking scanning mutagenese og in vitro transkription

20 Nogle Polymerase III promotorer ligger internt i genet

21 Deletionsmapning viser 5’ placeringen af den interne klasse III promotor In vitro transkription

22 Strategi for at bestemme 3’ enden af den interne klasse III promotor. Inkorporering af dATP, som terminerer transkriptionen.

23 Tilsætning af dATP + ATP i in vitro transkriptionen fører til fem karakteriske pre-terminerede transkripter

24 Site-directed mutagenese af klasse III promotorer viser nedenstående strukturer

25 Nogle RNA polymerase III promotorer er placeret 5’ i f.h.t. Transkriptionsstartsitet.

26

27 Enhancers DNA elementer der kan ligge mange kilobaser fra promotoren Orienteringen i forhold til promotoren er ligegyldig Kan binde transkriptionsfaktorer Silencers Ændrer kromatinstrukturen så transkription forhindres

28 Generelle eukaryote transkriptionsfaktorer

29 Klasse II preinitieringskomplekset indeholder RNA polymerase II samt TFIIA, B, D, E, F og H

30 Hvorledes preinitieringskomplekset dannes kan undersøges ved EMSA analyse udført med oprensede TFII faktorer og DNA indeholdende en promoter Hvor i promotoren de enkelte faktorer binder kan analyseres ved foot-printing

31

32 Rækkefølgem i dannelsen af pre- initieringskomplekset er TFIID, TFIIB, TFIIF + pol II, TFIIE og TFIIH

33 Kontakten mellem de enkelte pre- initieringskomplekser og promotoren bestemmes ved footprinting

34 Bestemmelse af hvor preinitieringskomplekset binder til en klasse II promoter

35 Copyright © The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Etablering af preinitieringskomplekset bindingsstedet ud fra footprint analyse

36 TFIID består af TBP (TATA-box-binding protein) og 8-10 associerede TAF II (TBP associated factors) proteiner

37 TFIID binder til minor groove EMSA assay

38 EMSA assay med TATA box oligo eller CICI oligo lane 1, 4, 7 gær lane 1, 4, 7 menneske

39 Copyright © The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display.

40 TBP nødvendig for transkription fra alle 3 typer promotorer Vist med gærekstrakt indeholdende temperatursensitiv TBP protein

41 Copyright © The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. TAFs identificeres efter pull- down og SDS-PAGE

42 Bindingssitet for TBP og hele TFIID bestemmes med footprinting og viser beskyttelse af en region omkring TATA boxen samt regioner 35 baser efter transkriptionsstartsitet Kunne være kontakt til initiator og/eller downstream elementer

43 Copyright © The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Tilstedværelse af initiator og DPE kræver TFIID for maksimal aktivitet

44 Hvilke TAF’s binder Inr og DPE ? Cross-linking med 5- bromouracil mærket promoter element

45 Copyright © The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. Foot-print viser at TAFII genkender initiator og evt. DPE

46 Copyright © The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display.

47 TFIID nødvendig for interaktion med Sp1 bhTBP, bakteriel fremstillet human TBP vhTBP, vaccinia virus fremstillet human TBP

48 Hvilke TAF’s binder til Sp1 ?

49 Copyright © The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. En promotor med 3 GC boxe og en TATA box. Drosophila eller humane proteiner i et rekonstitueret system

50 TFIIH Har ni subunits En kinase del En helikase/ATPase del

51 Tilstedeværelse af TFIIH forårsager fosforylering af RNA pol II.

52 TFIIH fosforylerer RNA pol II og stimuleres af de øvrige transkrptionskomplekser

53 TFIIH fosforylerer CTD TFIIH fosforylerer kun CTD i tilstedværelse af TATA box

54 TFIIH har ATP afhængig helikase aktivitet Stigende mængder af gær RAD25

55 Copyright © The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display.

56 TFIIS påvirker elongeringshastigheden og har proof-reading funktion

57 Indkorporering af radioaktiv GMP øges ved tilsætning af TFIIS

58 Initiering ikke påvirket af TFIIS

59 Strategien for at undersøge proof- reading aktivitet i TFIIS

60

61 Proofreading model

62 Generelle polymerase I faktorer

63 Kun to generelle faktorer 1)SL1, TIF-1B 2)UBF (upstream binding factor)

64 Copyright © The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display. human SL1 stimulerer transkription af human rRNA gener i et muse proteinekstrakt

65 UBF og SL1 binder promotoren, ikke Pol. I

66 SL1 og UBF stimulerer transkription fra rRNA promotorer

67 SL1 består af TBP + 3 TAFs

68

69 3 generelle transkriptionsfaktorer nødvendige for Pol III aktivitet TFIIIB TFIIIC TFIIIA (kun for 5S rRNA)

70 TFIIIA nødvendig for transkription in vitro fra 5S rRNA promotorer, men ikkefra t-RNA promotorer TFIIIA inaktiveret med et antistof

71 footprint af tRNA gen og c) intet protein a)polIII + TFIIIB og TFIIIC b)polIII + TFIIIB og TFIIIC + NTP (- GTP)

72

73 Figure 11.41

74 Copyright © The McGraw-Hill Companies, Inc. Permission required for reproduction or display.

75