1 第三节 肽 一、肽的结构 二、生物活性肽. 2 肽 肽是氨基酸的线性聚合物。 肽的获得 氨基酸缩合而形成 蛋白质水解产生.

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1 1 第三节 肽 一、肽的结构 二、生物活性肽

2 2 肽 肽是氨基酸的线性聚合物。 肽的获得 氨基酸缩合而形成 蛋白质水解产生

3 3 一. 肽的结构 氨基酸顺序与命名 氨基酸残基 / 寡肽与多肽 / 环肽 N 端 C 端

4 4 1. 肽键的特点 具有部分双键特性，不能 自由旋转。 肽键的亚氨基没有明显的 解离和质子化。 除脯氨酸外多以反式结构 存在。..

5 5 肽平面、肽单位、二面角

6 6 注意  在开链肽的 N 端和 C 端可以有游离的 α 氨基和 α 羧基，而有的开链肽的 N 端或 C 端的游离的 α 氨基或 α 羧基可被别的基团结合（如烷基化、 酰化等）或 N 端残基自身环化（如：谷氨酸）。  脯氨酸在 N 端没有游离的 α 氨基。

7 7 多肽中的二硫键 22 二硫键

8 8 2. 肽与氨基酸的离子化程度 肽的酸碱性质－－决定于末端 α- 氨基和 α- 羧基及 R 基 它们的解离常数与游离氨基酸中的不同。 N 端 C 端

9 9 天然存在的重要多肽  以蛋白质形式存在 : 相对分子质量在 6000 以上的多肽称为蛋白质。  以天然活性肽形式存在： ①分子量比较小的多肽以游离状态存在。通常都具有 特殊的生理功能，常称为活性肽。 ②在天然活性肽中含有非蛋白质氨基酸和肽键。

10 10 二、生物活性肽 (Natural peptide) 脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽； 蛇毒多肽等

11 11 1. 谷胱甘肽： γ- 谷氨酰半胱氨酰甘氨酸 COOH CHNH 2 CH 2 CO NH － CH － CO － NH － CH 2 － COOH γ α 还原型谷胱甘肽 GSH CH 2 SH γ Glu － Cys － Gly S S 氧化型谷胱甘肽 GSSG

12 12 谷胱甘肽重要的生物功能  在体内氧化还原过程中起重要的作用。  作为抗氧化剂维护蛋白质活性中心的巯基游离。  参与二硫化合物相互转化。  GSH ：在红细胞中作为巯基缓冲剂存在，维持血红蛋白 和其他红细胞蛋白质的半胱氨酸残基处于还原态。  作为药物治疗肝病

13 13 2. 神经肽 主要存在于中枢神经系统的一类活性肽。 主要包括： 吗啡样肽 P －物质（ 11 肽 )

14 14 ①脑啡肽（五肽） Leu- 脑啡肽和 Met- 脑啡肽。 ＋ H 3 N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO － ＋ H 3 N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO － 前体物：前脑啡肽原（含 267 个残基）

15 15 ②内啡肽 包括 α －内啡肽（ 16 肽） β －内啡肽（ 31 肽） γ －内啡肽（ 17 肽） 前体物：促黑素促皮质激素原

16 16 3. 抗菌肽 抗菌肽 : 一类具有很强抗菌能力的肽. 抗生素 : 由特定微生物产生. 是一类抑制细菌和其他微生物 生长或繁殖的物质. 针对引起炎症的微生物，是杀灭微生 物的. 抗菌药 : 主要是杀灭细菌的。

17 17 ①青霉素 氨基酸的二肽衍生物。 作用机理：破坏细菌细胞壁糖肽的合成。

18 18 ②短杆菌肽（ 10 肽） 抗菌机理：改变细胞质膜的通透性，以至破坏膜的双层 结构，使胞内物质外漏而致细胞死亡。并且对人和动物 细胞膜起同样作用，故临床使用受到很大限制。

19 19 ③放线菌素 放线菌素一种从土壤细菌中提取的红色的，通常是有毒 的多肽抗生素。 作用机理：抑制 RNA 的合成，作用于 mRNA 干扰细胞 的转录过程。

20 20 其它活性肽

21 21 肽的应用及发展 近年来，多肽的分离纯化、结构分析、化学合成、生物、 放射免疫测定、免疫细胞化学以及遗传工程等新技术的 应用，新的活性肽不断发现，对活性肽功能认识不断增 长，促使这一领域迅速发展

22 22 第四节 蛋白质的分子结构 一、蛋白质的一级结构 二、蛋白质的空间结构 三、蛋白质的结构与功能的统一性

23 23 蛋白质结构的不同组织层次（ 20 世纪 50 年代） 结构组织层次：一、二、三、四级结构。 介于二和三级结构之间：超二级结构和结构域

24 24 一、蛋白质的一级结构 （平面结构、化学结构、共价结构 ） 1. 概念：指肽链中的氨基酸顺序。（维持键－－肽键） 是蛋白质空间结构和生理功能的基础。 N 端 C 端

25 25 2. 一级结构的测定（测序） 步骤 测定蛋白质分子中多肽链的数目 拆分蛋白质分子的多肽链和二硫键 分析每一多肽链的氨基酸组成 测定多肽链的氨基酸序列 确定肽段在多肽链中的次序 确定原多肽链中二硫键的位置

26 26 第一步：测定蛋白质分子中多肽链的数目 测定末端基（ C 端或 N 端），看蛋白质的摩尔数与末端 基的摩尔数的比例？ 若 1 ： 1 ？ 1 ： 2 ？ 1 ： 3 ？

27 27 第二步：拆分蛋白质分子的多肽链和二硫键 借助非共价相互作用缔合的 采用变性剂： 8mol/L 尿素； 6mol/L 盐酸胍； SDS 处理。 通过共价二硫桥（－ S － S －）交联的肽链 采用氧化剂或还原剂：将二硫键断裂。 分离、纯化多肽链：电泳、层析等方法。 猪

28 28 ①还原法：二硫键的断裂 使用的还原剂有：  巯基乙醇（  - 巯基乙醇 H0 － CH 2 CH 2 － SH ）、  巯基乙酸、  二硫苏糖醇（ DTT ）

29 29 为防止巯基重新氧化，可用碘乙酸、碘乙酰胺等使 其烷化

30 30 ②氧化法：二硫键的断裂 二硫键用过甲酸氧化为磺酸基而拆开

31 31 第三步：分析每一多肽链的氨基酸组成 待测样品经酸 (6mol/L HCl) 和碱 (5mol/L NaOH) 完全水解。 用氨基酸分析仪进行测定（强阳离子交换）。测定水解 液中的氨基酸组成和比例，氨量。

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33 33 练习题 常用来打开二硫键的试剂有 __ 和 __ 。 我国于 ____ 年在世界上首次合成了具有生物活性的蛋白质 结晶牛胰岛素。 在一些天然肽中含有 __ 、和 _ 等特殊结构。这些结构在蛋 白质中是不存在的。很可能这些结构上的变化可使这些肽 免受蛋白水解酶的作用。 Sanger 试剂是 A. 苯异硫氰酸 ((PITC 法 ) B.2 ， 4- 二硝基氟苯 (FDNB 法 ) C. 丹磺酰氯 (DNS-Cl 法 ) D. β- 巯基乙醇 谷胱苷肽结构特点及生物功能？

34 34 一级结构的测定（测序） 步骤 测定蛋白质分子中多肽链的数目 拆分蛋白质分子的多肽链和二硫键 分析每一多肽链的氨基酸组成 测定多肽链的氨基酸序列 确定肽段在多肽链中的次序 确定原多肽链中二硫键的位置

35 35 第四步：测定多肽链的氨基酸序列 N －末端氨基酸测定 C －末端分析 多肽链的部分裂解和肽段混合物的 分离纯化 NH 2 COOH

36 36 （ 1 ）肽链末端分析 N- 末端分析 C- 末端分析 N 端 C 端

37 37 ① N- 末端分析 二硝基氟苯法（ FDNB 法） 二甲基氨基萘磺酰氯法（ DNS-Cl 法） 异硫氰酸苯酯法（ Edman 法） 氨肽酶法

38 38 2,4 －二硝基氟苯法 （ Sanger 试剂， DNFB 或 FDNB ）  1945 年由 Sanger 发明此法，曾用此方 法经 10 年测定了牛胰 岛素的的一级结构。 单肽链＋ FDNB DNP －肽链（黄色） DNP －（ N 端）氨基酸 ＋ n 个氨基酸 弱碱 6mol 盐酸中 乙醚抽提后层析，与标准 DNP －氨基 酸比较，确定 N 端氨基酸？

39 39 苯异硫氰酸酯（ PITC 、 Edman 法） 特点：是能够不断重复循环，将肽链 N- 端氨基酸 残基逐一进行标记和解离。  一次可以连续测出 80 个左右的残基顺序。大的肽 链测序前要化大为小，不能采用全水解。  氨基酸序列自动分析仪是以此法为原理设计的。

40 40 单肽链＋ PITC PTC －肽链（黄色） PTH －（ N 端，环化）氨基酸 ＋ 余下少一个氨基酸的肽链 弱碱 乙醚抽提后层析，与标准 PTH －氨基 酸比较，确定 N 端氨基酸？ 硝基甲烷中，加酸，加热

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42 42 二甲基氨基萘磺酰氯法（ DNS-Cl 法） 1956 年 hartley 等提出 灵敏度较高（比 FDNB 法提高 100 倍），样品量小于 1 毫微摩尔， DNS- 氨基酸稳定性较高。

43 43 氨肽酶法：从 N 端依次切断肽键 氨肽酶是一类肽链外切酶（ exopeptidases H 2 NVal － His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu － Lys COOH

44 44 ② C －末端分析 肼解法 羧肽酶法

45 45 肼解法 无冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸被破坏不易测定出。 无水加热 －

46 46 羧肽酶法 根据氨基酸释放的动力学曲线， 可确定该肽链的 C 端氨基酸顺序。 (C- 末端第二个是 Pro 时不 作用） NH 2 COOH 主要方法 t Phe Glu Leu

47 47 ③多肽链部分裂解和肽段混合物的分离纯化 要求：选用专一性强的、断裂点少的、反应产率高的蛋白水 解酶或化学试剂进行有控制的裂解。后将所得混合物进行分 离纯化。经 N 未端和 C 未端测定，确定出每一肽段的序列。 选用 A 选用 B

48 48 酶解法 （表现出专一性） 酶 专一性抑制水解 胰蛋白酶 糜蛋白酶（胰凝 乳蛋白酶） R 1 ＝赖或精侧链， AECys R 1 ＝苯丙、酪、色；亮、蛋、组 R 2 ＝脯

49 49 R1= 赖氨酸 Lys 或精氨酸 Arg 侧链（专一性较强，水解 速度快） 水解位点

50 50 或胰凝乳蛋白酶： R1= 苯丙氨酸 Phe, 色 氨酸 Trp, 酪氨酸 Tyr; 亮氨酸 Leu ，蛋氨酸 Met 和组氨酸 His 水解 稍慢 水解位点

51 51 Pepsin ： R1 为苯丙 氨酸 Phe, 色氨酸 Trp, 酪氨酸 Tyr 或谷氨酸 Glu ，天门东氨酸 Asp; 亮氨酸 Leu 以及 其它疏水性氨基酸水 解速度较慢 水解位点

52 52 thermolysin ： R2= 苯丙氨酸 Phe, 色氨酸 Trp, 酪氨 酸 Tyr; 亮氨酸 Leu ，异亮氨酸 Ileu, 蛋氨酸 Met 以及 其它疏水性强的氨基酸水解速度较快 水解位点

53 53 化学法  溴化氰水解法 (CNBr): 切割 Met 的羧基所形成的肽键。  用羟胺断裂 : 它断裂－ Asn-Gly-, 但专一性不高。

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55 55 第五步：确定肽段在多肽链中的次序 所得资料： N －末端残基 H C －末端残基 S 第一套肽段 OUS PS EOVE RLA HOWT 第二套肽段 SEO WTOU VERL APS HO 借助重叠肽确定肽段次序： HOWT OUS EOVERLAPS

56 56 第六步：确定原多肽链中二硫键的位置 采用胃蛋白酶：专一性低，切点多。肽段比较小，分离、 鉴定比较容易。作用 pH 在酸性范围。 肽段混合物进行的对角线电泳

57 57 对角线电泳 暴露在过 甲酸蒸气 中使二硫 键断裂 + +

58 58 巯基的保护

59 59 酰胺基位置的确定 用酸处理含酰胺基的肽链，使其产生游离的 NH 3 和－ COOH 。 测出 NH3 的数量和可能形成的－ COOH 的数量（不包括 C 端）， 如两者相等，就可以确定酰胺基的位置

60 60 （胰岛 β －细胞产生，图 4 － 3 58 页） 牛胰岛素的一级结构 （胰岛 β －细胞产生，图 4 － 3 58 页） 主要功能 : 是降低体内血糖含量。 1953 年 F.Sanger 等测定出了牛胰岛 素的氨基酸顺序。每种蛋白质都具 有特异而严格的氨基酸种类、数量 和排列顺序的一级结构。 1965 年 9 月，中国科学院生物化学 研究所、有机化学研究所和北京大 学化学系协作，在世界上第一次人 工合成了结晶牛胰岛素。 猪

61 61 S S S S S S A NH 2 B NH 2 6 11 7 7 20 19 COOH 21 肽 30 肽

62 62 例：有一个 A 肽？ ①酸水解得到： Ala 、 Arg 、 Ser 、 Glu 、 Phe 、 Met ； ②当 A 肽与 FDNB 试剂反应后得： DNP-Ala ； ③当 A 肽用 CNBr 降解时得到：游离的 Ser 和一种肽 ； ④当 A 肽用胰蛋白酶降解时得到两种肽： 一种含 Ala 、 Arg ， 另一种含其它氨基酸 ⑤当 A 肽用糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）降解时得到两种肽： 一种含 Met 、 Ser ， 另一种含其它氨基酸； 问 A 肽的氨基酸排列顺序如何？ 答： Ala － Arg － Glu － phe － Met － Ser

63 63 思考题 肽键及肽键的特点 天然生物活性肽及结构特点 谷胱苷肽结构特点及生物功能、抗菌肽 蛋白质一级结构及序列测定步骤