Varmeresistente bakterier i sygehusmiljøet

Præsentationer af emnet: "Varmeresistente bakterier i sygehusmiljøet"— Præsentationens transcript:

1 Varmeresistente bakterier i sygehusmiljøet
Karen A. Krogfelt, prof Martin S. Bojer, phd-stud Afd Mikrobiologi og Infektionskontrol Statens Serum Institut

2 Antibiotikaresistensens onde cirkel
B. Kristensen: ,SSI

3 Multiresistente bakterier
The good (ydre overflader, ex hud) MRSA The bad (indre overflader, ex tarm) ESBL, VRE The ugly ( stor spredningspotentiale, høj mortalitet) NDM-1 og andre carbapenemase-dannende bakterier CD027 B. Kristensen, SSI

4 Varmeresistens ….

5 Historien… Gentamicin-resistente enterobakterier, Hvidovre Hospital.
Mindst 10 infektioner over 2-år på intensivafdelingen af multiresistente K. pneumoniae-isolater, kapsel serotype K28 Ribotypning viste at isolater er klonale

6 Virulens undersøgelse af C132-98
Adhæsion til humane epithelceller Evne til at kolonisere tarmen Infektionsevne i urinvejsinfektions model C er ikke mere virulent end andre kliniske K. pneumoniae isolater (Struve & Krogfelt, 2004)

7 til at persistere i hospitalsmiljøet ?
Har C forøget evne til at persistere i hospitalsmiljøet ? C overlever ved høje temperaturer 58°C Special-apparatur, f.eks. endoskoper, varmebehandles ved temperaturer under 60 °C. Temperatur kritisk for at minimere ”bacterial load” (Zühlsdorf et al., 2003)

8 Varmeresistens gen ? C har mange plasmider Er varmeresistens plasmid-kodet? C plasmid DNA skæres med Sau3A Ligeres med plasmid vektor Plasmid-klon bibliotek i E. coli Forskellige plasmid kloner

9 Selektion af varmeresistens
Restriktionsanalyse af individuelle kloner Restriktionsanalyse af individuelle kolonier Præ-selektion pool Gentagen varmeselektion Post-selektion pool 4x 58 °C i 5 min 384 clones 1 klon? Én varmeresistent klon selekteret

10 Sekventering af varmeresistent klon
Varmeresistent klon (8.187 kb fragment fra K. pneumoniae C132-98) Clp ATPase sHSP hypothetical proteins 93 aa aa aa aa aa aa aa Putative metalloprotease Clp ATPase genet (clpK) medierer varmeresistens

11 kloning af clpK 53°C clpK-genet alene medierer varmeresistens

12 K. pneumoniae C132-98 varmeresistens = clpK?

13 ClpK på konjugative plasmid
C C132Δclp DH5α tetracycline resistant transformants ClpK på største plasmid (ca.150 kb) i C132-98

14 Funktion af Clp ATPpaser
Funktionel gruppe I Clp ATPaser involveret i ClpP-afhængig proteolyse (ClpA, ClpC, ClpX) Protein destined for degradation Binding ClpP double-heptameric proteolytic complex Clp hexamer Degradation Translocation Catalyzed denaturation (Modificeret fra Karzai et al. (2000))

15 Funktion af Clp ATPpaser
Funktionel gruppe II ClpP uafhængige, medierer protein-disaggregering (ClpB) ClpB cross-section Insoluble aggregate Extraction & threading of polypeptide Interaction of ClpB, DnaK & protein aggregate DnaK chaperone system Release of unfolded polypeptide Spontaneous or chaperone mediated refolding Pore (Modificeret fra Doyle et al. (2007))

16 ClpK er en ny type Clp ATPase
Funktionel gruppe I (ClpP afhængig proteolyse) C-terminal AAA-2 M-domain AAA-1 N-terminal ClpA ClpX ClpC P tripeptide Gram-negatives Both Gram-positives Funktionel gruppe II (protein disaggregering) ClpB C-terminal AAA-2 M-domain AAA-1 N-terminal Both ClpK N-terminal AAA-1 M-domain AAA-2 C-terminal Bojer et al., 2012

17 clpK hos K. pneumoniae 105 kliniske isolater screenet med clpK specifik DNA probe 31 isolater positive! ClpK er vidt udbredt blandt kliniske isolater (30%)

18 clpK- K. pneumoniae er varmeresistente
Bojer et al., 2010

19 Varmebehandling af biofilm 5 min v. 58 °C
clpK og K. pneumoniae biofilm Varmebehandling af biofilm 5 min v. 58 °C Bojer et al., 2011

20 clpK på ESBL-plasmider
Dansk samling af ESBL-positive K. pneumoniae blodisolater fra 2008 (Lester et al., 2010) 24% positive Findes i større sjællandsk klon ST16 Bojer et al., 2012

21 clpK på ESBL-plasmider
MLST antal Antal isolater i dette PFGE/MLST-cluster (Lester et al.) Genotype ESBL-konjugation ST15 1 38 CTX-M-15, SHV-28, TEM-1 + (IncFIIk, clpK) ST16 9 CTX-M-15, SHV-1, TEM-1 ST110 2 5 CTX-M-15, SHV-12 - ST11 3 DHA-1 ST474 CTX-M-15, SHV-11, TEM-1 + (IncFIIk) ST469 + (IncN) ST20 CTX-M-14, SHV-11 + tet, neo, sulpha, trim!! 53°C 53°C

22 I ALT Varmeresistens i persisterende stamme på sygehus
Varmeresistens er plasmid-kodet og medieret af ny type af Clp ATPase :clpK clpK er hyppigt forekommende hos kliniske K. pneumoniae isolater Tydelig sammenhæng mellem tilstedeværelse af clpK og varmeresistens clpK medierer varmetolerance også for biofilm clpK er påvist på konjugerbart multiresistens-plasmid i bl.a. udbredt sjællandsk ST16-klon

23 I ALT Tydelig sammenhæng mellem clpK og varmeresistens
clpK medierer varmetolerance også for biofilm clpK er på konjugerbart multiresistens-plasmid

24 Hvad så? Findes clpK i andre relevante species?
Giver ClpK anledning til andre stress-fænotyper? Findes clpK i andre relevante species? Fødevare-sikkerhed/tilberedning? Vask ved lav temperatur? ClpK selektion??

25 TAK Deltagende parter Anette M. Hammerum , SSI Hanne Ingmer, KU-Sund
Dennis S. Hansen, Hillerød Sygehus Carsten Struve, SSI 58 °C i 5 min 384 clones 1 klon