Cold-PCR & Droplet Digital PCR

Præsentationer af emnet: "Cold-PCR & Droplet Digital PCR"— Præsentationens transcript:

1 Cold-PCR & Droplet Digital PCR

2 ”Fortynding” af cancer med normale celler
Cancercelle ”fortyndet” i normale celler

3 Cold-PCR vs konventionel PCR

4 Lightscanner & heteroduplex princip
Heteroduplexer Homoduplexer A T A C G T A T G C G C

5 Fortyndinger og LightScanner resultater
Ved forbrug af 50ng DNA/reaktion vil forholdet mellem WT kopier og variant DNA kopier være følgende: 1: % /8325 kopier 1: % /1665 kopier 1: % /833 kopier 1: ,5% /416 kopier 1: ,25% /208 kopier 1: ,625% /104 kopier 1: ,3125% /52 kopier

6 Sekventering af fortyndinger Konventionel vs Cold-PCR
Cold-PCR – diverse fortyndinger 10% 5% 2,5% 1,25% 0,625% Konventionel PCR – heterozygot 1:1 Konventionel PCR – fortynding 1:20

7 Reference-artikel Coren A. Milbury et al. Clin.Chem.

8 Droplet Digital PCR Introduktion

9 Taqman-prober til detektion (1)
FRET Match Mismatch

10 Taqman-prober til detektion (2)
SNP: A  T VIC A T FRET FAM

11 Taqman kromatogram (3)

12 Droplet Digital PCR – 3rd Generation af PCR
Kvantificering 1st 2nd 3rd Real-time PCR Relativ Kvantificering Droplet Digital PCR Absolut Kvantificering

13 Droplet Digital PCR Workflow
Mix reagenser og prøver i 20,000 droplets Udfør PCR på termocycler Kvantificer target DNA/RNA ved at tælle prøve-droplets via fluorescence-signal Digital aflæsning giver absolut måling af target DNA Lav Droplets PCR Droplets Aflæs Droplets

14 Produktion af Droplets
Placer engangs cartridge med prøver og droplet-olie i QX100 Droplet Generator 20,000 droplets per prøve, 2 ½ min for 8 prøver Ensartede droplets 14

15 Droplets på PCR maskine
Forskellige experimenter på samme plade Er ikke låst fast i specifikke PCR protokoller, men kan tilpasses det ønskede target Overfør emulsion til 96-brønds PCR plade

16 Aflæsning af Droplets Load 96-pladen i QX100 Droplet Readeren
Autosampler håndterer den enkelte prøve uafhængigt Droplets ledes forbi optisk detector, der detekterer flourescenssignal fra hver droplet (32 brønde / time) 16

17 Precision fra 10% fortyndinger
1.1-fold fortyndingsrække af S. aureus Konstant humant gDNA

18 Copy Number Variation ddPCR individual wells ddPCR merged wells
DNA fra 7 cellelinier med kendt copy number variation Resultaterne er normaliseret overfor en kopi af RNase P ddPCR individual wells ddPCR merged wells 18

19 BRAF V600E fortynding af DNA

20